包春秀，姜永紅

上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院兒科（上海 200032）

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是引發(fā)兒童常見呼吸道感染的病原之一，肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）可占社區(qū)獲得性肺炎的20%～40%［1-2］，臨床表現(xiàn)常見發(fā)熱、咳嗽、痰壅、氣喘等，重癥MPP 可引起肺外并發(fā)癥［3］。目前MPP 的發(fā)病機制尚未完全明確，有學者［4］認為MP 感染后可能通過Toll 樣受體（TLR）信號通路誘導肺部炎癥反應并加重肺損傷?！澳c-肺軸”近年來得到學界廣泛關注。腸道微生物群可以通過參與宿主免疫從而調節(jié)肺部感染［5］。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，腸道益生菌能夠激活TLR 信號系統(tǒng)，保護機體免受炎癥傷害。盡管近10 年來腸道菌群研究取得了巨大進展，但腸道微生物與MPP 的相關研究報道缺失，且中醫(yī)藥對MPP 患者腸道菌群的作用機制尚不清楚。加味宣白承氣湯是我們課題組臨床治療MPP 的有效經(jīng)驗方，由“肺腸同治”經(jīng)典名方宣白承氣湯化裁而來。本實驗在復制MPP小鼠模型的基礎上，就加味宣白承氣湯對MPP小鼠TLR4信號通路的調控作用進行研究，并進一步觀察中藥對MPP 小鼠腸道菌群及免疫的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 30 只4 周齡BALB/c 小鼠（SPF 級雄性），體質量（16±2）g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，檢疫后備用。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016。動物使用合格證號：SYXK（滬）2016-0004。實驗過程中所有操作均符合上海睿太莫斯生物科技有限公司實驗動物倫理委員會規(guī)定［倫理批準號：202010（16）］。所有動物小鼠在SPF 級動物房隔離飼養(yǎng)，自由攝取標準顆粒飼料和水，并在適應3 d后開始實驗。

1.1.2 藥物與試劑 ①中藥：加味宣白承氣湯選用免煎顆粒，每包含量為生石膏9 g、杏仁5 g、瓜蔞5 g、制大黃3 g、桑白皮5 g、葶藶子5 g、炙麻黃3 g、枳殼5 g、浙貝母5 g、生甘草3 g。以上藥物由四川新綠藥業(yè)科技發(fā)展有限公司加工為免煎配方顆粒劑。②菌株：肺炎支原體國際標準株（MPFH），由美國 ATCC 公司提供（批號：ATCC15531）。③試劑：糞便DNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司（批號：DP328）； DNA 凝膠回收試劑盒，美國Axygen 公司（批號：AP-GX-50）；SYBR Green PCR 試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific 公司（批號：#K0223）；分泌型免疫球蛋白A（sIgA）檢測試劑盒，上海信裕生物技術有限公司（批號：XY-E11466）；小鼠γ 干擾素（IFN-γ）、轉化生長因子-β（TGF-β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）和白介素-17（IL-17）的酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒，美國RayBiotech 公司（批號：CUSABIO）；二辛可酸法（BCA）蛋白定量試劑盒，碧云天生物技術有限公司（批號：P0012）。④抗體：Toll樣受體4（TLR4），英國Abcam 公司（批號：Ab217274）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，美國CST 公司（批號：#5174）；羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗，上海碧云天生物技術有限公司（批號：A0208）。

1.1.3 主要儀器 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測儀，美國ABI公司（型號：ABI-7300）；低溫冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司（型號：TG-16M）；旋渦振蕩器，上海青浦瀘西儀器廠（型號：K30）；電泳儀，美國Bio-Rad 公司（型號：mini protean 3 cell）；電轉儀，大連競邁科技有限公司（型號：PS-9）；酶標分析儀，芬蘭Labsystems 公司（型號：MK3）；水浴鍋，德國Leica 公司（型號：HI1210）；成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司（型號：Tanon-5200）；電動勻漿機，德國Fluko公司（型號：PRO200）。

1.2 分組 30只BALB/c小鼠隨機分為空白組、模型組和加味宣白承氣湯組，每組10只。

1.3 造模與干預 空白組以50 μL 無菌鹽水滴鼻，模型組及加味宣白承氣湯組均以MPFH 溶劑50 μL（含1×107ccu/mL）緩慢滴入鼻腔并使其進入氣管，連續(xù)3 d。

根據(jù)Bios 氏公式換算小鼠用藥劑量［7］：Db=Da（Kb/Ka）（Wa/Wb）1/3。1 劑藥物共48 g，溶于20 mL 蒸餾水，濃度為2.4 g/mL，灌胃量為每20 g 小鼠體質量0.25 mL，相當于人臨床用量的10 倍。空白組與模型組在造模的同時采用質量分數(shù)為0.9%的氯化鈉溶液灌胃；加味宣白承氣湯組在造模的同時采用加味宣白承氣湯溶液灌胃，灌胃量均為每20 g小鼠體質量0.25 mL。每日1次，連續(xù)3 d。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 小鼠一般情況 觀察小鼠精神狀態(tài)、被毛亮澤度、呼吸頻率、排便情況等一般狀態(tài)。

1.4.2 肺、腸組織病理切片 實驗第4 天，取小鼠左側部分肺組織放置于4%多聚甲醛中，石蠟包埋和蘇木精-伊紅（HE）染色；取結腸組織約1.5 cm，置于4%多聚甲醛浸泡后包埋切片。HE 染色，用顯微鏡拍照并在光鏡下觀察各組肺、腸組織的形態(tài)學改變。

1.4.3 肺炎支原體脫氧核糖體（MP-DNA）含量 MPDNA 含量檢測方法：取20 mg 肺組織，根據(jù)支原體DNA提取試劑盒說明書提取肺組織中支原體DNA，進行檢測，具體RT-qPCR 擴增步驟按照ABI7300 擴增儀的標準操作程序進行。同時，利用MP 陽性標準品按1×105、1×106、1×107、1×108拷貝數(shù)/ mL 的模式進行RT-qPCR 檢測，以初始循環(huán)數(shù)（Ct）值與支原體拷貝數(shù)構建標準曲線。最后，根據(jù)標準曲線公式計算出肺組織中支原體的拷貝數(shù)。具體PCR 擴增步驟按照ABI7300 擴增儀的標準操作程序進行；數(shù)據(jù)分析采用ABI Prism 7300 SDS軟件。

1.4.4 腸道菌群數(shù)量 取小鼠新鮮糞便2 g，凍存在-80 ℃冰箱備檢，采用RT-qPCR法檢測小鼠糞便中丁酸梭菌、黃瘤胃球菌數(shù)量。①提取糞便細菌總DNA：用糞便基因組DNA 提取試劑盒提取細菌總DNA，具體步驟按操作說明進行，得到的DNA 溶液放置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。②制備標準曲線：以各標準菌株PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠、回收后所得的DNA片段作為標準品，在分光光度計上測定4 種菌群PCR 產(chǎn)物的吸光度（A260）；參考分子克隆，對應雙鏈DNA片段1吸光度值相當于4.74×1013分子/mL，計算出4 種菌PCR 產(chǎn)物的拷貝數(shù)，再用滅菌水系列稀釋10 倍，以104～109拷貝/μL 作為模板進行熒光定量PCR 擴增；縱坐標為PCR 過程中出現(xiàn)熒光信號的Ct值，橫坐標為各模板不同拷貝數(shù)的對數(shù)值，隨后做出標準曲線，得到截距（b）、斜率（k）及相關性，最后將所有標本的X代入回歸方程Y=（X-b）/k（Y代表Ct 值，X代表各模板量的對數(shù)值），計算出4 種菌群DNA 拷貝數(shù)的對數(shù)，再換算成DNA 拷貝數(shù)×5 即得每克糞便中細菌的DNA 拷貝數(shù)。③糞便樣品16 S rRNA 定量分析：將待測糞便樣品中提取的DNA 分別進行具體菌種16 S rRNA 熒光定量PCR 反應。反應體系25 μL：SYBR 混合物12.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各0.5 μL，雙蒸水（dd H2O）6.4 μL，待測DNA 樣品或標準品2 μL。反應條件：95 ℃變性30 s， 95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min；循環(huán)40 次；熔解95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，冷卻60 ℃、15 s。將10 倍系列稀釋的標準品與糞便細菌DNA 樣品同時進行RT-qPCR 反應，反應完畢后根據(jù)熔解曲線分析PCR 產(chǎn)物的特異性，根據(jù)Ct值及標準曲線計算每克糞便樣品中待測細菌基因的拷貝數(shù)，作為定量結果。擴增引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4.5 糞便sIgA 含量 取小鼠新鮮糞便2 g，凍存在-80 ℃冰箱備檢，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測所有小鼠糞便中sIgA 水平。檢測方法：糞便樣本離心20 min 后取上清液，置于-80 ℃冰箱保存待檢。按照試劑盒說明書進行操作，分別設空白孔、標準孔和待測樣品孔，各孔加入50 μL 相應樣品后，于37 ℃條件下孵育30 min，0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗板5 次；加入酶標試劑（IgA 與HRP 標記的抗原結合形成抗原-抗體-酶標抗原復合物）50 μL/孔，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS 洗板5 次；加入顯色液A、B（50 μL/孔），37 ℃避光顯色10 min；加入終止液（50 μL/孔），終止反應；酶標儀450 nm 波長處測量各孔OD 值，繪制標準曲線，計算糞便中sIgA含量。

1.4.6 IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17 水平 采集小鼠肺泡灌洗液（BALF）：將右側主支氣管夾閉分離，4 ℃質量分數(shù)為0.9%的氯化鈉溶液0.5 mL×3 次灌洗左肺后回收，1 200 r/min 離心10 min，取上清以備檢測。采用ELISA 法檢測所有小鼠BALF 中IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17 水平。檢測方法：用無菌管收集樣本，以2 000～3 000 r/min 離心20 min 后取上清液；試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，在室溫放置15～30 min 后使用。按ELISA 試劑盒說明書操作，在450 mm 波長一次測量各孔吸光度值，通過回執(zhí)標準曲線求出標本中IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17的實際濃度。

1.4.7 TLR4 蛋白含量 取小鼠右側肺組織、結腸組織各1 cm，采用Western blot 法檢測TLR4 蛋白的表達。將小鼠肺、腸組織按每20 mg 組織加入150～250 μL 裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清。BCA 法測定細胞總蛋白濃度。各孔取肺、腸組織TLR4 蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離（濃縮膠80 V電壓，20 min；分離膠120 V電壓，60 min）。將分離后的蛋白電轉移（25 V 電壓，30 min）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。加入5%脫脂奶粉［檢測磷酸化蛋白用牛血清白蛋白（BSA）封閉液于搖床上室溫封閉1 h；分別加入一抗（體積稀釋比例均為TLR4 1∶300，GAPDH 1∶2 000），4 ℃條件下反應過夜。次日先以等滲鹽溶液加Tris-HCl 緩沖液（TBST）洗膜3 次，每次5 min。后加入 HRP 標記的二抗（體積稀釋比例為1∶1 000），室溫反應1 h。再用 TBST 洗膜3 次，每次5 min。按增強型化學發(fā)光（ECL）試劑盒說明進行顯影。采用凝膠圖像處理系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進行分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用±s表示。組間比較采用One-Way Anova法的相關程序進行方差齊性檢驗，如果方差齊可進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 程序；如果方差不齊則先用Rank Cases 程序進行變量變換，再用單因素方差分析，采用LSD 程序兩兩比較。運用Person 相關系數(shù)描述小鼠腸道菌群數(shù)量與炎癥因子水平的相關性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism8.0軟件繪制相關性分析散點圖。

2 結果

2.1 對小鼠一般情況的影響 實驗前各組小鼠均精神飽滿、被毛光亮、呼吸均勻、排便正常。經(jīng)干預后，空白組小鼠被毛光亮、精神活躍、呼吸均勻、大便正常；模型組小鼠被毛暗淡、煩躁不安、活動減少、呼吸短促、大便質干量少；加味宣白承氣湯組小鼠被毛較暗淡、精神一般、呼吸略促，大便質尚可、量較少。

2.2 對小鼠肺、腸組織病理的影響 空白組肺組織結構完好，支氣管和肺泡無顯著病變，未見炎癥細胞浸潤。模型組肺組織結構不完整，支氣管周圍和肺間質見大量炎癥細胞浸潤，肺泡壁毛細血管擴張、增厚和破壞，肺泡間隔增厚，細支氣管壁增厚，支氣管管腔變窄。加味宣白承氣湯組肺組織結構大部分完整，中支氣管周圍和肺間質可見少量炎癥細胞浸潤，肺泡壁毛細血管輕度擴張，較少部分肺泡壁增厚，支氣管黏膜上皮水腫減輕，支氣管管腔變窄不顯著。見圖1。

圖1 各組小鼠肺、腸組織病理情況（HE染色，×200）

空白組腸組織結構正常，腸絨毛及腸黏膜無顯著病變，未見炎癥細胞浸潤。模型組腸絨毛腫脹顯著充血，固有層淋巴細胞、漿細胞浸潤，上皮細胞破碎，杯狀細胞減少。加味宣白承氣湯組腸絨毛腫脹稍充血，固有層淋巴細胞、漿細胞少量浸潤，杯狀細胞稍有減少。見圖1。

2.3 對小鼠肺組織中MP-DNA 含量的影響 空白組小鼠肺組織中MP-DNA 的含量為0，模型組與加味宣白承氣湯組小鼠肺組織中均有MP-DNA，提示造模成功。與模型組比較，加味宣白承氣湯組小鼠肺組織中的MPDNA 含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肺組織中MP-DNA含量比較（n=10，±s，logCo/g）

表2 各組小鼠肺組織中MP-DNA含量比較（n=10，±s，logCo/g）

注：MP-DNA 為肺炎支原體脫氧核糖體。與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

MP-DNA 0 6.96±0.16*6.36±0.21*#組別空白組模型組加味宣白承氣湯組

2.4 對小鼠糞標本中黃瘤胃球菌、丁酸梭菌數(shù)量的影響 與空白組比較，模型組及加味宣白承氣湯組小鼠腸道黃瘤胃球菌、丁酸梭菌數(shù)量均有顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，加味宣白承氣湯組腸道黃瘤胃球菌、丁酸梭菌菌群數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腸道黃瘤胃球菌、丁酸梭菌數(shù)量比較（n=10，±s，logCo/g）

表3 各組小鼠腸道黃瘤胃球菌、丁酸梭菌數(shù)量比較（n=10，±s，logCo/g）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別空白組模型組加味宣白承氣湯組丁酸梭菌8.15±0.20 7.09±0.20*7.53±0.27*#黃瘤胃球菌7.24±0.15 6.67±0.12*6.92±0.13*#

2.5 對小鼠糞標本中sIgA含量的影響 與空白組比較，模型組及加味宣白承氣湯組小鼠腸道sIgA含量均顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，加味宣白承氣湯組sIgA含量顯著增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠糞標本中sIgA含量比較（n=10，±s，mg·L-1）

表4 各組小鼠糞標本中sIgA含量比較（n=10，±s，mg·L-1）

注：sIgA 為分泌型免疫球蛋白A。與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

sIgA 942.13±130.80 513.61±65.47*683.72±138.59*#組別空白組模型組加味宣白承氣湯組

2.6 對小鼠BALF 中IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10 及IL-17含量的影響 與空白組比較，模型組及加味宣白承氣湯組BALF 中的IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10 和IL-17 含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，加味宣白承氣湯組IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10 和IL-17 含量顯著下降（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10及IL-17含量比較（n=10，±s，ng·L-1）

表5 各組小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10及IL-17含量比較（n=10，±s，ng·L-1）

注：IFN-γ 為γ 干擾素；TGF-β 為轉化生長因子-β；IL-6 為白介素-6，IL-10 為白介素-10，IL-17 為白介素-17。與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

IL-17 39.18±6.70 98.10±16.87*68.20±10.15*#組別空白組模型組加味宣白承氣湯組IFN-γ 200.03±41.05 398.17±49.19*292.05±57.99*#TGF-β 42.33±9.50 88.58±8.71*59.56±12.66*#IL-6 18.32±2.78 32.55±3.00*24.61±3.13*#IL-10 80.24±12.47 206.03±34.23*151.80±29.37*#

2.7 小鼠腸道菌群數(shù)量與炎癥因子水平的相關性 黃瘤胃球菌與炎癥因子相關性：黃瘤胃球菌與IFN-γ 呈負相關關系，相關系數(shù)為-0.799，P=0.006（P＜0.05）；黃瘤胃球菌與TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17 之間的相關系數(shù)無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6、圖2。

圖2 腸道菌群數(shù)量與IFN-γ含量相關性分析散點圖

表6 黃瘤胃球菌、丁酸梭菌與IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10和IL-17的相關系數(shù)（n=10）

丁酸梭菌與炎癥因子相關性：丁酸梭菌與IFN-γ呈負相關關系，相關系數(shù)為-0.719，P=0.019（P＜0.05）；丁酸梭菌與TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17 之間的相關系數(shù)無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6、圖2。

2.8 對小鼠肺組織、腸組織中TLR4 蛋白表達的影響與空白組比較，模型組及加味宣白承氣湯組小鼠肺組織TLR4 蛋白的表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，加味宣白承氣湯組小鼠肺組織TLR4 蛋白的表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表7、圖3。

圖3 各組小鼠肺組織中TLR4蛋白電泳條帶圖

表7 各組小鼠肺、腸組織中TLR4蛋白表達比較（n=6，±s，g·L-1）

表7 各組小鼠肺、腸組織中TLR4蛋白表達比較（n=6，±s，g·L-1）

注：TLR4 為Toll 樣受體4。與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

腸組織0.35±0.11 0.79±0.12*0.42±0.12#組別空白組模型組加味宣白承氣湯組肺組織0.25±0.06 0.75±0.10*0.57±0.17*#

與空白組比較，模型組小鼠腸組織TLR4 蛋白的表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，加味宣白承氣湯組TLR4 蛋白在腸組織的表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表7、圖4。

圖4 各組小鼠腸組織中TLR4蛋白電泳條帶圖

3 討論

MP 是呼吸道感染的常見病原體，介于細菌和病毒之間，能夠獨立生存，主要通過飛沫傳播［1-2］。有研究［8］指出，MP 感染可誘發(fā)哮喘，并能引起慢性咳嗽，其肺外臟器受累可達到45%，嚴重影響兒童的身心健康。目前，MPP 的發(fā)病機制尚未明確。有研究［9-10］表明，兒童在MP感染后某些細胞因子被激活，并分泌相關炎癥因子，從而導致患兒免疫功能下降，且其免疫紊亂程度與MPP 疾病嚴重程度有關。目前本病的臨床用藥首選大環(huán)內(nèi)酯類藥物。近年來有關MP 耐藥的報道逐漸增多，有報道［11］指出，MP 陽性菌株中的耐藥菌株超過90%。MP 感染及抗生素的使用，易致MPP 患兒腸道微生物紊亂，破壞腸道微生態(tài)平衡，進而嚴重影響患兒的生長發(fā)育［12］。中醫(yī)藥具備多靶點、多環(huán)節(jié)的治療作用，對治療兒童MPP具有一定優(yōu)勢。

MPP 屬中醫(yī)學“肺炎喘嗽”病范疇，其主要病因病機為邪氣侵襲肺衛(wèi)。小兒形氣未充，肺臟嬌嫩，外邪易由口鼻或皮毛而入，使得肺失宣肅、肺氣郁閉。支原體時邪入里易迅速化熱，熱蒸津液，煉液為痰，痰阻氣道，壅盛于肺，痰熱互結，肺氣郁閉，失于宣降，導致氣急、鼻煽、痰鳴喉中、胸悶脹滿、泛吐痰涎。肺主通調水道，痰熱郁閉肺氣，肺失宣肅，上中下三焦津液輸布失調，又熱傷津液，糟粕與熱結于腸，使大腸傳導失司，氣機不運，則常伴有大便干結等腸道癥狀。病變在肺，肺病及腸，表里同病，上宣下導失司，痰熱之邪滯留臟腑，郁而化熱，甚則熱傳心肝，可致病情加重。治療上應清肺定喘，瀉熱通便。

加味宣白承氣湯由“肺腸同治”經(jīng)典代表方宣白承氣湯化裁而來，由桑白皮、生石膏、制大黃、炙麻黃、葶藶子、杏仁、瓜蔞、浙貝母、枳殼、生甘草組成。方中桑白皮瀉肺平喘、利水消腫，生石膏清氣分邪熱、透邪出肌表，共為君藥。炙麻黃宣肺平喘，葶藶子瀉肺利水，杏仁上宣肺氣、兼潤腸通便，大黃瀉陽明實熱；四藥合用，宣肺中郁熱，承腸胃積熱，宣發(fā)肅降，上下兼顧，寓有“釜底抽薪”之意，共為臣藥。瓜蔞潤肺化痰通便，合桑白皮、生石膏宣肺、清肺、潤肺，浙貝母清熱化痰，枳殼理氣寬胸、行滯消積，共為佐藥。生甘草和中扶正、調和諸藥而為使藥。全方諸藥相合，清肺通腑并用，宣肺平喘為主，泄熱通腑為輔，一宣一降，使得痰熱二邪有路可出，肺氣得以宣肅如常，腸腑得以泄熱排濁，則病轉自愈。

在現(xiàn)代醫(yī)學關于腸道及肺部感染有關的研究報道中提到“腸-肺軸”理論［13-14］，這與中醫(yī)學“肺與大腸相表里”理論不謀而合?！吨赜喭ㄋ讉摗吩疲骸胺螝馍夏?，咯痰黃濃，或白而黏，胸膈滿痛，神昏譫語，腹?jié)M脹疼，便閉溺澀……此肺中痰火，與胃中熱結而成下證也……陷胸承氣湯主之?！逼浞文c同治，開降肺氣以通大腸，使肺與大腸肅降有權則邪熱自解。這充分體現(xiàn)了肺與大腸的密切關系，故有肺病治腸、腸病治肺、肺腸同治等治療原則。腸腑熱盛，迫津下泄則“利遂不止”，同時，腸腑熱盛，上迫于肺，出現(xiàn)“喘而汗出”。肺與大腸相表里，二者之中任何一方受病，均可上下相傳，累及同病［15］。在人體免疫系統(tǒng)中，腸道被認為是最大的免疫器官。通過腸道微生物及微生物產(chǎn)物可影響人體免疫反應，繼而可調控呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后［5］。腸道微生物可通過作用于局部免疫細胞繼而作用于黏膜免疫系統(tǒng)，這些免疫細胞可促進腸黏膜內(nèi)B 細胞分化為分泌型IgA，并且通過免疫淋巴樣細胞（ILCs）來活化細胞因子的釋放。不同類型的淋巴細胞在成熟時進入外周免疫系統(tǒng)并定位在不同淋巴器官內(nèi)，部分淋巴細胞脫離淋巴器官進入體內(nèi)淋巴液和血液循環(huán)，最終這些帶有抗原的淋巴細胞又重新回到對應淋巴器官內(nèi)，從而完成淋巴細胞的再循環(huán)［16］。通過機體的這種“歸巢”作用和免疫應答，使得肺和腸組織之間相互聯(lián)系，這種“腸-肺軸”也成為兩個器官之間的免疫連接。由此可見，腸道菌群在呼吸道感染中扮演著重要角色。本研究結果顯示，模型組小鼠腸道黃瘤胃球菌、丁酸梭菌及sIgA 含量均較空白組顯著減少，BALF 中的炎癥因子IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10 和IL-17 水平顯著升高，其肺、腸組織病理切片較空白組均有一定程度的破壞和炎性浸潤，說明MP 感染可導致機體的一系列炎癥反應，使肺、腸組織損傷，造成腸道黃瘤胃球菌、丁酸梭菌菌群數(shù)量減少，sIgA 的分泌降低，進而損傷腸道黏膜屏障，使腸黏膜免疫及體液免疫紊亂。有多項研究［17-19］證明，細菌、病毒等引起的肺部感染會使下呼吸道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，引起宿主腸道微生物菌群的變遷和失衡，同時伴隨著黏膜屏障、免疫功能的受損，進一步促進肺部感染的發(fā)展。這與本研究得出的結果相一致。

呼吸道的菌群紊亂會通過免疫調節(jié)作用于消化道，相反腸道菌群變化會通過黏膜免疫系統(tǒng)對呼吸道產(chǎn)生作用。有研究［20］證實，嬰幼兒的腸道菌群可對未來的肺部健康造成影響。菌群通過腸道及呼吸道上皮細胞滲透進入嬰幼兒身體完成定殖，并由此產(chǎn)生對病原體的抵抗力［21］。研究［22］發(fā)現(xiàn)，MPP 兒童腸道中的黃瘤胃球菌及丁酸梭菌的顯著減少對肺部炎癥反應有一定負面影響，即黃瘤胃球菌及丁酸梭菌的減少可能是引發(fā)MPP兒童喘息的危險因素之一。丁酸梭菌分泌的丁酸可修復腸黏膜，并促進乳桿菌和雙歧桿菌的生長，抑制腸道有害菌生長，從而恢復腸道菌群的平衡［23］。丁酸梭菌還能抑制抗結腸抗體免疫球蛋白G（IgG）過度表達，降低B淋巴細胞轉化率，提高T淋巴細胞轉化率，進而糾正腸免疫紊亂，恢復腸免疫耐受力［24］。本研究觀察炎癥因子與黃瘤胃球菌、丁酸梭菌的相關性，發(fā)現(xiàn)黃瘤胃球菌及丁酸梭菌與IFN-γ水平均呈負相關，提示黃瘤胃球菌及丁酸梭菌的減少是促進機體炎癥因子產(chǎn)生的危險因素。

隨著腸道微生態(tài)學和免疫學研究的不斷深入，已證實腸道菌群紊亂和MP 感染發(fā)病有一定的相關性。有研究［25-27］證明，MP 感染后出現(xiàn)的一系列炎癥反應與TLR2、TLR4的基因表達有重要關聯(lián)。TLR 是一類參與炎癥過程的重要蛋白。TLR 信號通路的傳導可使炎癥細胞因子、趨化因子和抗原呈遞分子等在機體中起到防御作用的物質被激活［28］。研究［29］發(fā)現(xiàn)，腸道益生菌能夠調節(jié)腸道黏膜的炎癥反應，這些益生菌能夠激活TLR 信號系統(tǒng)，保護腸道免受炎癥傷害，并減少由炎癥傷害造成的死亡。研究［30］證明，丁酸梭菌通過抑制結腸上皮轉錄因子PU.1與TLR4啟動子結合區(qū)相結合，有效減少TLR4 蛋白的激活和炎癥因子釋放，提示TLR4是丁酸的重要靶標。本研究發(fā)現(xiàn)，MPP 小鼠肺、腸組織中TLR4蛋白表達均增加，說明MP 感染可通過TLR4途徑影響機體免疫及腸道免疫，腸黏膜屏障受損，引起腸道菌群失調，腸道菌群失調又進一步加重肺部感染。

我們認為，MP 可通過上呼吸道感染肺部，打破肺內(nèi)的菌群生態(tài)平衡，引起肺部炎癥反應，激活TLR4，釋放IFN-γ 等促炎癥因子，促炎癥因子通過血液、淋巴循環(huán)和“腸-肺軸”，作用于腸道黏膜免疫系統(tǒng)，減少腸道有益菌群數(shù)量，降低sIgA 分泌，損壞腸道黏膜免疫屏障功能，臨床上出現(xiàn)肺腸同病癥狀。進而腸道微生態(tài)被破壞，有益菌減少，腸道黏膜屏障sIgA 分泌減少，相對致病菌增加，或腸道菌群代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸，釋放促炎癥細胞因子，通過黏膜淋巴細胞“歸巢”作用，攜帶抗原又回到肺部，進一步加重肺部炎癥情況。本研究結果顯示，加味宣白承氣湯組腸道黃瘤胃球菌、丁酸梭菌菌群數(shù)量及sIgA 含量顯著增多，血清炎癥因子水平顯著下降，肺、腸組織TLR4 蛋白表達降低，肺、腸病理切片炎性滲出顯著減少，提示加味宣白承氣湯可有效增加腸道黃瘤胃球菌、丁酸梭菌的數(shù)量，修復腸道黏膜免疫功能，增加sIgA 蛋白的分泌，阻斷上游因子TLR4 蛋白的表達，減少炎癥因子的釋放，改善MPP 肺、腸組織的損傷，促進機體腸道微生態(tài)及免疫的平衡。

綜上所述，加味宣白承氣湯對MPP 小鼠的腸道微生態(tài)及免疫系統(tǒng)均有一定的調節(jié)作用。但本次研究腸道菌群的選擇有限，無法體現(xiàn)少量特殊菌群可能存在的影響，因此需要進一步研究并探索MPP 腸道宏基因組特點及中藥對“腸-肺軸”的干預機制與靶點。