賀少龍,文恩輝,費(fèi)平霞,黨宏萬(wàn),魏世杰*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 藥劑科,寧夏 銀川 750000;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 臨床藥理研究室,寧夏 銀川 750000;3.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710077)

丁苯酞(Butyphthalide,NBP)是我國(guó)藥學(xué)人員自主研發(fā)的國(guó)家一類新藥(商品名為恩必妥),其主要作用機(jī)制為改善腦缺血區(qū)微循環(huán),《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南》推薦其作為腦卒中患者改善腦血循環(huán)的藥物[1];阿托伐他汀鈣(Atorvastatin Calcium,ATV)為國(guó)際上急性缺血性卒中的治療和二級(jí)預(yù)防的推薦藥物[2],在臨床輕、中度急性缺血性腦卒中治療中,兩藥聯(lián)用可明顯改善患者的神經(jīng)功能和血管彈性[3-4],但其藥代動(dòng)力學(xué)相互作用仍需探討研究。旨在建立一種簡(jiǎn)單高效測(cè)定丁苯酞血藥濃度的方法,為臨床血藥濃度檢測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究奠定理論基礎(chǔ);并研究ATV對(duì)大鼠體內(nèi)NBP藥動(dòng)學(xué)參數(shù)是否存在影響,為NBP臨床合理配伍應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu 30A超高液相色譜儀,日本島津公司產(chǎn)品;API 4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀和Analyst 1.5.1分析操作軟件均為美國(guó)AB公司產(chǎn)品;Centrifuge 5804R低溫離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;XH-B渦旋混合器,姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司;AE240分析天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 藥品與試劑

丁苯酞對(duì)照品(純度>99.6%,批號(hào):101035-201502),購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院;地西泮對(duì)照品純度>99.9%,批號(hào):110805-200508),購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院;丁苯酞軟膠囊(批號(hào)118170609,國(guó)藥準(zhǔn)字H20050299,規(guī)格0.1 g/粒),由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn);阿托伐他汀鈣片(批號(hào)201710001,國(guó)藥準(zhǔn)字H20133127,規(guī)格10 mg/片),羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na 批號(hào):20150812),均由浙江新東港藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);市售植物油;色譜甲醇和乙腈(美國(guó)Fisher公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水;其他溶劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年清潔級(jí)SD大鼠14只,雌雄各半,體重(250±30)g,由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(寧)2016-0021。實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食不禁水。

2 方法

2.1 色譜、質(zhì)譜條件

色譜條件 色譜柱:Phenomenex Kinetex-C18色譜柱(50.0 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:0.1%甲酸(A相)-乙腈(B相),梯度洗脫(0～0.6 min,90%A;0.6～1.2 min,90% → 7% A;1.2～2.6 min,7% A;2.6～3.0 min,7% → 90% A;3.5 min停止);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量:3 μL。

質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI),正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源噴霧電壓:5.5 kV;源溫:500 ℃;霧化氣:276 kPa;輔助加熱氣:276 kPa;氣簾氣:69 kPa;碰撞氣:55 kPa。NBP和內(nèi)標(biāo)(地西泮)在MRM 模式下的定量監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為m/z 191.1→145.1(NBP),m/z 285.6→193.1(內(nèi)標(biāo))。

2.2 溶液配置

NBP、地西泮儲(chǔ)備液和工作液:分別精密稱取NBP對(duì)照品、地西泮適量,用甲醇溶解,配置成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取一定量的內(nèi)標(biāo)(地西泮)儲(chǔ)備液,用甲醇稀釋制備內(nèi)標(biāo)工作液(10 ng·mL-1),置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

NBP油溶液:取NBP軟膠囊6粒(規(guī)格0.1 g/粒),使用注射器將膠囊內(nèi)全部藥液移出,用植物油將收集的藥液稀釋成30 mg·mL-1NBP油溶液備用。

ATV混懸液:精密稱取ATV原料藥12.011 mg,用0.25% CMC-Na溶液配置ATV(1 mg·mL-1)混懸液。

2.3 分組給藥方法及血樣采集

采用隨機(jī)平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),將雌雄各半共14只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)和實(shí)驗(yàn)組(B組),每組7只,單次灌胃給藥。A組灌胃給予NBP油溶液(70 mg·kg-1)+0.25% CMC-Na溶液;B組灌胃給予NBP油溶液(70 mg·kg-1)+ ATV混懸液(用0.25% CMC-Na配制,8 mg·kg-1)。單次給藥前(0 h)和給藥后0.083,0.167,0.25,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,12,24 h采集血樣,每次眼眶采血0.3 mL至肝素鈉涂壁的EP管中,4 000 r·min-1離心5 min,移取上層血漿置于-70 ℃低溫冷凍冰箱中備用。

2.4 血漿樣品處理

準(zhǔn)確移取大鼠血漿100 μL置1.5 mLEP管中,加內(nèi)標(biāo)(地西泮1 mg·mL-1)20 μL,旋渦振蕩1 min,加乙腈300 μL,旋渦混合振蕩3 min,在4 ℃下,以1.4×104r·min-1離心10 min,取上清液3 μL進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 專屬性

分別取不同的來源的6份空白大鼠血漿100 μL,除不加內(nèi)標(biāo)地西泮溶液外,其余步驟按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣后得到空白樣品的色譜圖。另取一定質(zhì)量濃度的NBP、地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白血漿中,采用上述相同步驟處理。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

取大鼠空白血漿190 μL,依次加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL,配制成NBP質(zhì)量 濃度為5,10,20,50,100,500,1 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作。以待測(cè)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y,待測(cè)物濃度(c)為橫坐標(biāo)X用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.3 精密度與回收率

取大鼠空白血漿190 μL,標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL依次加入,配制成NBP質(zhì)量濃度為10,100,800 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿,每個(gè)濃度6份平行樣本,按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作。同法連續(xù)操作3 d,計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和絕對(duì)提取回收率。

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)

按“血漿樣品處理”項(xiàng)下方法操作,處理來源不同的6份空白大鼠血漿,依次加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的NBP對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,將得到的NBP和內(nèi)標(biāo)峰面積除以相應(yīng)濃度的NBP對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液直接同體積進(jìn)樣得到的峰面積,計(jì)算血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)NBP和內(nèi)標(biāo)的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng),再以NBP的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)除以內(nèi)標(biāo)的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng),得到NBP的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)。

2.5.5 稀釋因子試驗(yàn)

將濃度為4 000 ng·mL-1NBP溶液稀釋5倍后其測(cè)定值乘以相應(yīng)的稀釋因子后與對(duì)應(yīng)的理論值做比較。

2.5.6 穩(wěn)定性

用大鼠空白血漿配制含NBP質(zhì)量濃度為10,100,800 ng·mL-1各6份,室溫條件下放置24 h,按“血漿樣品處理”項(xiàng)處理進(jìn)樣,考察室溫放置24 h血漿樣本的穩(wěn)定性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果以表示,運(yùn)用DAS 2.0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),用11.0版SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專屬性

待測(cè)物NBP和內(nèi)標(biāo)地西泮的色譜圖如圖1所示,在本測(cè)定條件下,NBP和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為2.10 min和2.05 min,空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾NBP和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

A: 空白血漿大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)改變;B: 空白血漿+地西泮;C: 空白血漿+NBP;D: 灌胃NBP 0.5 h后采集的大鼠血漿樣品圖1 待測(cè)物NBP和內(nèi)標(biāo)地西泮的色譜圖

3.1.2 線性范圍

NBP的線性范圍為5～1 000 ng·mL-1,定量下限為5 ng·mL-1,定量下限的相對(duì)偏差(RE)在-3.4%～7.2%,精密度RSD為11.43%,得到線性回歸方程:Y=0.012 7X+0.266(r=0.997 3),結(jié)果表明待測(cè)物在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性。

3.1.3 精密度與準(zhǔn)確度

表1結(jié)果顯示,測(cè)得NBP的三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品相對(duì)回收率均>85%,日內(nèi)和日間精密度RSD均小于15%,提示該方法準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性較好,可以用于血漿中NBP含量測(cè)定。

表1 血漿中NBP的精密度及回收率

3.1.4 基質(zhì)效應(yīng)與稀釋效應(yīng)

質(zhì)量濃度為10,100,800 ng·mL-1的NBP血漿樣品經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)分別為(99.9±0.11)%,(93.6±0.05)%和(96.1±0.03)%;大鼠血漿中內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)為(84.8 ± 2.4)%,生物樣品的基質(zhì)效應(yīng)不影響待測(cè)物濃度測(cè)定,符合定量要求。稀釋效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明,待測(cè)物實(shí)際值與測(cè)定值RE和RSD分別為-3.13%和3.73%,提示待測(cè)血漿藥品超過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量上限時(shí),將樣品稀釋5倍后測(cè)定,結(jié)果仍然可靠。

3.1.5 穩(wěn)定性

低、中、高濃度的NBP大鼠血漿樣品在室溫下放置24 h后的RSD分別為13.54%,7.87%和9.05%,說明含NBP血漿樣品在室溫條件、24 h內(nèi)測(cè)定分析過程穩(wěn)定性良好。溶液穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、長(zhǎng)期穩(wěn)定性已有文獻(xiàn)報(bào)道,故未重復(fù)驗(yàn)證[5-6]。

3.2 藥動(dòng)學(xué)相互作用

3.2.1 血藥濃度-時(shí)間曲線

A組和B組單次灌胃給藥后丁苯酞的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2 。

A組:NBP;B組:NBP+ATV

3.2.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

采用DAS 2.0軟件計(jì)算NBP藥動(dòng)學(xué)參數(shù),結(jié)果表明ATV與NBP聯(lián)合使用會(huì)導(dǎo)致后者在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)改變。ATV引起NBP藥動(dòng)學(xué)參數(shù)改變:Vz增加、t1/2、MRT0-t延長(zhǎng),見表2。

表2 NBP在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4 討論

本研究采用HPLC-MS/MS法可在3 min內(nèi)測(cè)定丁苯酞血藥濃度,采用乙腈沉淀蛋白,檢測(cè)效率高,操作簡(jiǎn)單,回收率高,能滿足臨床血藥濃度快速檢測(cè)和相關(guān)藥動(dòng)學(xué)研究的需要。

藥動(dòng)學(xué)相互作用可以發(fā)生在藥物進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄等階段[7-8]。本研究顯示NBP在兩組大鼠體內(nèi)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t和Vz值改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明ATV對(duì)NBP吸收和組織分布影響不大。藥物體內(nèi)代謝性相互作用主要由肝臟CYP450酶系介導(dǎo),NBP在大鼠及人體內(nèi)主要經(jīng)過CYP2E、CYP3A和CYP2C代謝[9];ATV在體內(nèi)主要經(jīng)過CYP3A代謝,部分經(jīng)過CYP2C代謝[10]。研究結(jié)果顯示:單次NBP灌胃給藥與聯(lián)合使用后,聯(lián)合用藥組使得藥物滯留時(shí)間延長(zhǎng),其在體內(nèi)暴露增多,這可能與ATV和NBP兩藥競(jìng)爭(zhēng)共同的代謝酶有關(guān)。在臨床應(yīng)用時(shí),兩藥聯(lián)合應(yīng)注意調(diào)整劑量。

目前多種藥物聯(lián)合使用在臨床治療中非常普遍,尤其NBP作為一類新藥上市后藥物相互作用研究較少,并且相互作用機(jī)制復(fù)雜多樣[11]。對(duì)于長(zhǎng)期同服NBP及ATV的腦?；颊?本研究初步表明ATV可能與NBP競(jìng)爭(zhēng)共同作用代謝酶CYP3A和CYP2C,從而產(chǎn)生體內(nèi)藥物代謝相互作用,引起NBP藥理作用的改變。但研究結(jié)果來自于動(dòng)物單次給藥實(shí)驗(yàn),其在人體的藥代動(dòng)力學(xué)相互作用有必要進(jìn)一步設(shè)計(jì)探究。