侯繼鵬,陳美麗,崔祥禎,鄭華,時(shí)曉燕,張業(yè)華,郝貴周,張貴民

(魯南制藥集團(tuán)股份有限公司,國家手性制藥工程技術(shù)研究中心,山東 臨沂 273400)

三芐糖苷化學(xué)名稱為乙基-3,5,6-三芐基-D-呋喃葡萄糖苷,是由α體(α-乙基-3,5,6-三芐氧基-D-呋喃葡萄糖苷)和β體(β-乙基-3,5,6-三芐氧基-D-呋喃葡萄糖苷)兩種光學(xué)異構(gòu)體組成的一種混合物,α體和β體的組成質(zhì)量比例為1∶2。在強(qiáng)酸、光照及高溫條件下均不穩(wěn)定,易分解。它是一種毛細(xì)血管保護(hù)劑,具有抗炎、輕度鎮(zhèn)痛、抗毒素、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)纖維蛋白溶解等特性[1-3]。

在藥品進(jìn)行生產(chǎn)時(shí),通常會(huì)存在不同藥品使用同一生產(chǎn)設(shè)備以及生產(chǎn)線的現(xiàn)象,為防止藥品生產(chǎn)造成的交叉污染,需要生產(chǎn)完后設(shè)備上藥品殘留物進(jìn)行清潔研究[4-6]。當(dāng)生產(chǎn)三芐糖苷軟膠囊時(shí),為防止該產(chǎn)品對(duì)其共線藥品的交叉污染,同時(shí)根據(jù)三芐糖苷軟膠囊的處方組成,選擇三芐糖苷為指標(biāo)進(jìn)行設(shè)備清潔程度的研究。

根據(jù)藥品生產(chǎn)驗(yàn)證指南及GMP指南要求,殘留物限度計(jì)算通常采用以下三種方式:(1)基于日治療劑量的1/1 000計(jì)算;(2)基于最低限度10×10-6計(jì)算;(3)基于半數(shù)致死量計(jì)算[7-10]。通過以上3種方式經(jīng)計(jì)算得到生產(chǎn)設(shè)備三芐糖苷殘留的限度分別為2.153,0.040,12.558 μg/cm2。為保證共線生產(chǎn)藥品安全,選擇最嚴(yán)格的限度0.040 μg/cm2作為三芐糖苷限度要求,研究棉簽擦拭回收設(shè)備表面三芐糖苷的殘留量。

目前對(duì)于三芐糖苷的檢測(cè)僅見HPLC法和高碘酸法[11-13],但這兩種檢測(cè)方法靈敏度較低,定量限分別為0.03 mg/mL和12 mg/mL;且使用HPLC法分析樣品需要20 min以上,高碘酸法樣品制備則需要8 h以上,無法滿足三芐糖苷清潔驗(yàn)證中低限度及快速檢測(cè)的要求。本研究建立了滿足檢測(cè)靈敏度要求,且樣品分析在5 min內(nèi),準(zhǔn)確度更高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)法,用于快速檢驗(yàn)生產(chǎn)設(shè)備表面三芐糖苷殘留量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Vanquish TSQ Altis型超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司);十萬分之一電子天平MS105DU(瑞士Mettler Toledo公司);Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥

三芐糖苷對(duì)照品(高瑞耀業(yè),含量99.5%,批號(hào)201001-2101028);乙腈(質(zhì)譜級(jí)、Merck公司);乙醇(色譜級(jí)、Merck公司);水(超純水,美國Millipore 公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜條件:色譜柱 YMC Triart C18(2.1 mm×100 mm,1.9 μm);流動(dòng)相10 mmol/mL乙酸銨-乙腈(體積比15∶85);流速 0.2 mL/min;柱溫 40 ℃ ;進(jìn)樣量 2 μL。

質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧電離源(ESI),正離子模式采集;選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM),噴霧電壓為3 500 V,監(jiān)測(cè)離子對(duì)m/z496.21→181.18。

2.2 溶液配制

對(duì)照品溶液:精密稱取三芐糖苷適量,加95%乙醇溶解并定量稀釋制成10 μg/mL的溶液,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液;精密量取對(duì)照品貯備液適量,用95%乙醇稀釋制成每1 mL中約含10 ng的溶液。

供試品溶液:取擦拭過鋼板的棉簽,加95%乙醇50 mL超聲提取2 min后,用95%乙醇定容至100 mL。

2.3 棉簽擦拭方法

取1個(gè)棉簽,用一面按圖1 A所示,平穩(wěn)而緩慢地從水平方向擦拭整個(gè)取樣表面。然后翻轉(zhuǎn),用另一面按圖1 B所示讓其從垂直方向也進(jìn)行擦拭取樣。然后取另一支棉簽,依上述方法重復(fù)擦拭一遍。擦拭面積25 cm2。

圖1 棉簽擦拭方法

2.4 專屬性

取空白溶液(95%乙醇)、空白棉簽溶液、對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣,結(jié)果見圖2。三芐糖苷的β體和α體依次出峰,保留時(shí)間分別為2.609,3.155 min,兩者分離度大于1.5。空白溶液及空白棉簽溶液不干擾三芐糖苷的測(cè)定。

A.空白溶液;B.空白棉簽溶液;C.對(duì)照品溶液圖2 專屬性色譜圖

2.5 線性試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品貯備液0.02,0.05,0.08,0.1,0.15,0.2 mL分別置100 mL量瓶中,用95%乙醇稀釋至刻度,搖勻,作為線性與范圍試驗(yàn)溶液,分別進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。以濃度c為橫坐標(biāo),峰面積A(β和α之和)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=317.56c-70.54,r=0.999 8,表明三芐糖苷在2.09～20.86 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 定量限和檢測(cè)限

取對(duì)照品貯備液,用95%乙醇逐級(jí)稀釋至信噪比(S/N)約為10,得定量限溶液;用95%乙醇逐級(jí)稀釋至S/N約為3,得檢測(cè)限溶液。測(cè)得三芐糖苷的檢測(cè)限和定量限濃度分別為0.70和2.09 ng/mL。

2.7 方法回收率

配制3個(gè)濃度(2,10和15 ng/mL)的樣品溶液,各3份,進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得三芐糖苷方法回收率結(jié)果見表1,表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表1 方法回收率結(jié)果

2.8 棉簽回收率

精密移取三芐糖苷對(duì)照貯備溶液0.1 mL于棉簽上,干燥后,將棉簽放置于100 mL的容量瓶中,加95%乙醇50 mL超聲提取2 min后,用95%乙醇定容至100 mL,依法配制6份并進(jìn)樣對(duì)照溶液,按外標(biāo)法計(jì)算棉簽回收率,結(jié)果見表2,表明棉簽回收率良好。

表2 棉簽回收率結(jié)果

2.9 擦拭回收率

取表面光滑的304#不銹鋼平板一塊,劃出5 cm×5 cm的區(qū)域。精密移取三芐糖苷對(duì)照貯備溶液0.1 mL,在上述區(qū)域內(nèi)涂布均勻后,用棉簽按“2.3”項(xiàng)下方法擦拭。取擦拭過鋼板的棉簽,加95%乙醇50 mL超聲提取2 min后,用95%乙醇定容至100 mL,即得供試品溶液,重復(fù)制備6份,依法測(cè)定,結(jié)果見表3,表明擦拭回收率良好。

表3 擦拭回收率結(jié)果

2.10 精密度

精密量取對(duì)照品貯備液0.1 mL,置100 mL量瓶中,用95%乙醇稀釋至刻度,搖勻,配制6份,進(jìn)樣,計(jì)算三芐糖苷峰面積為的RSD(n=6)為0.50%,表明本法精密度良好。

2.11 穩(wěn)定性

取新配制的對(duì)照品溶液室溫放置,在0,1,2,4,6,8,10,12 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。計(jì)算得對(duì)照品溶液中三芐糖苷峰面積為的RSD為2.07%,這表明對(duì)照品溶液于室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

生產(chǎn)設(shè)備清潔用溶劑根據(jù)設(shè)備特點(diǎn)、溶劑成本及操作難易程度等一般會(huì)選擇水或者95%乙醇作為清潔溶劑[14]。經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)因三芐糖苷的極性較小,使用水作為清潔溶劑無法達(dá)到清潔限度要求,故將清潔溶劑選擇為95%乙醇,在進(jìn)行方法開發(fā)的時(shí)候稀釋液選擇也使用95%乙醇,以達(dá)到與清潔用溶劑一致的目的。

通過計(jì)算三芐糖苷的清潔限度較低,為納克級(jí)別的濃度水平,使用HPLC法已無法達(dá)到檢測(cè)靈敏度,因此開發(fā)了靈敏度更高的UPLC-MS/MS方法。經(jīng)離子對(duì)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)三芐糖苷的準(zhǔn)分子離子[M+H]響應(yīng)較小,而加合離子[M+NH4]響應(yīng)較高,故流動(dòng)相中加入乙酸銨,保證加合離子的穩(wěn)定性。

三芐糖苷是由β和α兩種異構(gòu)體組成的混合物,用外標(biāo)法以峰面積計(jì)算時(shí),采用了β和α峰面積之和。為了色譜圖中積分計(jì)算準(zhǔn)確,檢測(cè)方法中需要將β和α完全分開,通過改變流動(dòng)相中乙腈的比例,最終選擇10 mmol/L乙酸銨-乙腈(體積比15∶85)等度洗脫,三芐糖苷的兩個(gè)異構(gòu)體的分離較好,且樣品的分析在5 min內(nèi),可以更好地配合清潔操作的完成。

綜上所述,本研究中建立的UPLC-MS/MS法準(zhǔn)確、簡便、快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng),可用于清潔驗(yàn)證中三芐糖苷殘留物的快速定量分析。