李祖錦, 吳 敏, 孫傳衍

甲狀腺癌是最常見的甲狀腺惡性腫瘤,與其他惡性腫瘤相比,具有惡性程度較低、治療難度較小、患者預后較好的特點[1-2]。甲狀腺癌有多種病理類型,以乳頭狀癌最為常見,約占所有甲狀腺癌的85%～90%[3-4]。甲狀腺乳頭狀癌患者年齡分布較廣,且女性發(fā)病率約是男性的3倍,主要臨床表現(xiàn)為頸部腫塊、吞咽困難等,早發(fā)現(xiàn)、早治療對改善患者預后有積極作用[5]。整合素β4(integrin β4,ITGB4)是整合素家族的一員,主要表達于上皮細胞的基膜側(cè)。ITGB4胞外段可識別基底膜中的層黏連蛋白,與之構(gòu)成半橋粒連接。胞內(nèi)段由近1 000個氨基酸構(gòu)成,是胞內(nèi)段最長的整合素分子,參與BRAF/MEK/ERK等多條信號通路的調(diào)控,影響細胞增殖、凋亡與遷移等行為[6]。本文對甲狀腺乳頭狀癌組織標本的ITGB4蛋白進行檢測,旨在探討ITGB4蛋白在甲狀腺乳頭狀癌演進過程中的表達水平變化及臨床意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 招募2019年8月至2020年8月于海口市中醫(yī)醫(yī)院接受全甲狀腺切除術(shù)治療的甲狀腺乳頭狀癌老年患者80例。其中男29例,女51例,年齡66～78(71.5±4.8)歲;病理分期Ⅰ期29例,Ⅱ期40例,Ⅲ期7例,Ⅳ期4例;分化程度高分化15例,中分化44例,低分化21例。另選取同期于我院接受手術(shù)治療的結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者50例作為對照。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準[批號:(2019)倫審第(12)號],研究對象知情同意。

1.2納入與排除標準 納入標準:(1)符合《中國臨床腫瘤學會(CSCO)持續(xù)/復發(fā)及轉(zhuǎn)移性分化型甲狀腺癌診療指南-2019》[7]中關(guān)于甲狀腺乳頭狀癌的診斷標準,經(jīng)病理檢查明確診斷;(2)年齡>65歲;(3)接受甲狀腺乳頭狀癌腫瘤切除手術(shù);(4)臨床病歷資料完整。排除標準:(1)合并其他部位腫瘤;(2)合并全身感染性疾病;(3)合并免疫系統(tǒng)疾病;(4)合并嚴重心腦血管疾病;(5)精神障礙或交流障礙。

1.3標本切取及制片 術(shù)中切取患者癌組織及癌旁組織(距邊緣外至少2 cm,且HE染色未見異型細胞);切取結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者病灶組織。組織標本大小約為5 mm×5 mm×5 mm。經(jīng)10%甲醛溶液充分固定后,使用石蠟包埋,行組織切片,切片厚度3 μm,行免疫組化染色。

1.4免疫組化染色 將切割好的石蠟薄片置于恒溫水浴鍋內(nèi)展開,烘烤2 h,二甲苯脫蠟,梯度酒精水化。將切片置于甲醇溶液中浸泡,消除過氧化酶活性。使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)反復沖洗3次,沖洗過程中注意動作輕柔,防止損壞切片。經(jīng)檸檬酸鹽抗原修復后加入羊血清封閉20 min,PBS沖洗后加入一抗,4 ℃冰箱孵育過夜。以PBS輕柔沖洗后加入二抗,孵育2 h,采用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,經(jīng)蘇木素復染后封片。根據(jù)染色強度和染色細胞占比進行免疫組化染色強度評分:陰性為0分;弱陽性為1分;陽性為2分;強陽性為3分。根據(jù)良性腫瘤細胞占比進行免疫組化染色程度評分:無染色細胞為0分;染色細胞占1%～10%為1分;11%～50%為2分;51%～75%為3分;>75%為4分。免疫組化染色評分=染色強度評分×染色程度評分,得分0～4分為低表達(低表達組,39例),>4分為高表達(高表達組,41例)。

1.5Western blot法檢測ITGB4蛋白表達水平 取組織標本,剪碎研磨后加入600 μl組織裂解液裂解30 min,3 000 r/min離心10 min,取上清液。采用BCA法進行蛋白定量,在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白,100 ℃水浴5 min。經(jīng)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,予一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,每次清洗時長5 min。二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜3次,每次清洗時長5 min。DAB顯色,以GAPDH為內(nèi)參計算ITGB4蛋白的相對表達量。

1.6術(shù)后治療 甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)后需堅持服用甲狀腺素制劑,以補充甲狀腺素分泌的不足,防止甲狀腺功能低下;同時還可通過反饋性抑制作用,減少促甲狀腺素釋放,降低腫瘤復發(fā)率。

1.7隨訪 通過門診復查或電話等方式進行隨訪,隨訪截至2021年11月,觀察患者術(shù)后復發(fā)情況及生存情況。以頸部出現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、甲狀腺部位出現(xiàn)小的結(jié)節(jié)、面部水腫、聲音嘶啞等癥狀定義為復發(fā)。以出現(xiàn)復發(fā)或死亡定義為疾病進展。

2 結(jié)果

2.1ITGB4蛋白在不同組織中的表達水平比較 光鏡下可見ITGB4蛋白主要表達于細胞質(zhì)中。癌旁組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織細胞分布較為均勻,總體排列較為清晰。癌組織細胞呈現(xiàn)異常分布,排列不清晰。見圖1。甲狀腺乳頭狀癌組織ITGB4蛋白表達水平顯著高于癌旁組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織(P<0.05),癌旁組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織ITGB4蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2～3。

圖1 免疫組化染色結(jié)果圖(×400)

圖2 Western blot實驗結(jié)果圖

F=18.093,P<0.001;*P<0.05

2.2ITGB4蛋白表達水平與老年甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 ITGB4蛋白表達水平與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度存在顯著關(guān)聯(lián)性(P<0.05)。與TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者相比,Ⅲ～Ⅳ期患者ITGB4蛋白表達水平更高。與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ITGB4蛋白表達水平更高。與高分化患者相比,中、低分化患者ITGB4蛋白表達水平更高,且低分化患者的表達水平較中分化患者更高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ITGB4蛋白表達水平與老年甲狀腺乳頭狀癌患者臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果相對表達量]

2.3ITGB4蛋白表達水平與甲狀腺乳頭狀癌患者預后的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 截至2021年11月,甲狀腺乳頭狀癌患者中位隨訪時間為9個月,其中ITGB4高表達組失訪3例。在隨訪期間,ITGB4低表達組死亡3例,高表達組死亡11例,低表達組生存預后情況優(yōu)于高表達組(log-rank檢驗:χ2=5.175,P=0.023)。ITGB4低表達組進展5例,高表達組進展13例,低表達組無進展情況優(yōu)于高表達組(log-rank:χ2=6.541,P=0.011)。見圖4,5。

圖4 ITGB4蛋白高表達組與低表達組生存曲線圖

圖5 ITGB4蛋白高表達組與低表達組無進展生存曲線圖

3 討論

3.1甲狀腺癌是一種臨床較為常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤,甲狀腺癌分型中最為常見的類型為甲狀腺乳頭狀癌,與其他惡性腫瘤相比,甲狀腺乳頭狀癌惡性程度相對較低,預后較為理想[8-9]。但是也有研究表示,雖然甲狀腺乳頭狀癌患者惡性程度較低,但患者若得不到及時有效的治療,患者病情不斷惡化,會出現(xiàn)被膜侵襲、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況,嚴重威脅患者生命安全[10-11]。目前關(guān)于甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病機制尚不明確,加強相關(guān)研究有助于開發(fā)新的治療方法,改善患者預后[12-13]。

3.2惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤組織細胞的增殖、擴散具有密切聯(lián)系。ITGB4可通過胞外結(jié)構(gòu)域和基質(zhì)之間的相互作用轉(zhuǎn)導信號,參與細胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)化等生物學過程[14]。Sung等[15]研究結(jié)果顯示,ITGB4能夠通過偶聯(lián)活化多種受體酪氨酸激酶及非受體酪氨酸激酶,參與BRAF/MEK/ERK等多條信號通路的調(diào)控,從而影響細胞增殖、凋亡與遷移等行為。有臨床研究顯示,ITGB4在前列腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中異常表達[6,16],但其與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系還有待進一步研究。本研究結(jié)果顯示,甲狀腺乳頭狀癌組織中ITGB4的表達水平高于癌旁組織和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫,這與歐慧婷等[17]研究結(jié)果相似。分析其機制認為,腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管生成,其不僅為癌細胞生長提供營養(yǎng),也為癌細胞轉(zhuǎn)移提供通道;整合素即是介導細胞與細胞外基質(zhì)、細胞間黏附作用的主要因子,其在腫瘤血管生成的過程中起著重要作用。

3.3甲狀腺乳頭狀癌患者總體預后良好,但少數(shù)低分化、間變性或某些特殊組織類型的甲狀腺乳頭狀癌患者預后較差,易復發(fā)、轉(zhuǎn)移,易對放射性碘治療產(chǎn)生抵抗性。甲狀腺乳頭狀癌早期易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,引起腫瘤復發(fā),而一旦復發(fā)再次手術(shù)則相對困難,可能會增加手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生風險,從而影響患者的生活質(zhì)量,降低生存率[18]。本研究結(jié)果顯示,Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化的甲狀腺乳頭狀癌組織中ITGB4表達水平更高。分析其主要機制為,ITGB4屬于整合素家族的一種跨膜蛋白,生理狀態(tài)下介導細胞與細胞外基質(zhì)的黏附,在病理的狀態(tài)下會促進甲狀腺乳頭狀癌、鱗狀細胞癌等多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移進程。有研究發(fā)現(xiàn),ITGB4的表達水平與腫瘤TNM分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),其高表達患者的預后更差,復發(fā)率更高[15]。本研究結(jié)果也顯示ITGB4低表達的患者疾病進展風險更低、生存預后更好。結(jié)合既往研究結(jié)果,筆者認為ITGB4可能可以作為甲狀腺乳頭狀癌的治療靶點,并對患者的預后預測有重要的參考價值,值得進一步研究探討。

綜上所述,ITGB4蛋白在老年甲狀腺乳頭狀癌組織中呈高表達,且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度密切相關(guān),有助于臨床醫(yī)師對患者的預后情況進行評估。但本研究納入樣本量較少,結(jié)果可能存在一定偏倚,所得結(jié)論尚需通過多中心、大樣本量的前瞻性研究來進一步驗證。