趙文華, 郭伶娜

銀屑病是一種常見的免疫介導(dǎo)的皮膚疾病。有研究表明,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管生成素和血小板衍生生長(zhǎng)因子以及血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF),均可刺激銀屑病皮膚病變中血管生成[1-2]。其中vWF在初級(jí)止血中起著重要作用,可介導(dǎo)血小板黏附至血管損傷部位的內(nèi)皮下層。另外,vWF還可調(diào)節(jié)血管通透性和水腫形成,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和炎癥,并為補(bǔ)體激活提供激活表面,造成組織損傷[3]。vWF也被認(rèn)為是內(nèi)皮功能障礙和損傷的標(biāo)志物[4],并已在一些免疫介導(dǎo)的炎性疾病患者中發(fā)現(xiàn)vWF升高與心血管風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān),如炎癥性腸病[5]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[6]。銀屑病與動(dòng)脈粥樣硬化、內(nèi)皮功能障礙的關(guān)系以前已有報(bào)道[7]。而且高同型半胱氨酸血癥也是銀屑病患者動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成的危險(xiǎn)因素,并與vWF表達(dá)水平有關(guān)[8]。鑒此,本文旨在探討尋常型銀屑病患者血清和皮膚組織中vWF的表達(dá)水平及臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 招募2021年1月至2022年12月呂梁市人民醫(yī)院皮膚科收治的尋常型銀屑病患者30例(銀屑病組),年齡(49.76±11.02)歲,男22例,女8例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡>18歲;(2)符合《中國銀屑病診療指南(2018簡(jiǎn)版)》[9]中關(guān)于銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并炎癥性血管疾病,包括大動(dòng)脈炎和結(jié)節(jié)性動(dòng)脈炎等;(2)合并免疫介導(dǎo)的炎癥疾病,包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和脊柱關(guān)節(jié)炎等;(3)合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡或遺傳性血管性血友病;(4)妊娠或哺乳婦女;(5)在過去3個(gè)月內(nèi)接受全身治療,或在過去2周內(nèi)接受局部治療。另招募皮膚組織正常的外科手術(shù)(上、下肢骨折及肝膽胃腸手術(shù))患者30例作為對(duì)照組,年齡(43.93±10.53)歲,男18例,女12例。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2銀屑病嚴(yán)重程度評(píng)估 根據(jù)患者頭部、軀干、下肢和上肢4個(gè)身體部位的表面積受累情況及其脫屑、浸潤和紅斑的組織臨床特征進(jìn)行銀屑病面積嚴(yán)重指數(shù)(psoriasis area and severity index,PASI)評(píng)分,將銀屑病患者分為輕度(<10分)、中度(10～20分)和重度(>20分)三類[10]。本組患者中銀屑病嚴(yán)重程度為輕度者15例,中度者4例,重度者11例。

1.3血清vWF表達(dá)水平檢測(cè) 治療前抽取受試者早晨空腹靜脈血2.5 ml,置于EDTA-K2抗凝抽血管中,室溫靜置30 min,4 000 r/min離心10 min,收集血清,-80 ℃保存?zhèn)錂z。通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測(cè)血清vWF表達(dá)水平,試劑盒購自上海博湖生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4免疫組化染色 銀屑病組:自患病部位切取皮膚組織(1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm),其中取自下肢12例,上肢10例,軀干8例。對(duì)照組:切取手術(shù)傷口周圍的正常皮膚組織(1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm),其中取自下肢11例,上肢10例,軀干9例,兩組取材部位差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.102,P=0.950)。皮膚組織予10%福爾馬林進(jìn)行固定,梯度乙醇脫水,浸入二甲苯進(jìn)行透明化處理,最后浸漬在石蠟中。標(biāo)本切片厚度5 μm,將切片放在帶正電荷載玻片上,室溫下保存。采用兔抗vVF多克隆IgG抗體(美國CST公司)對(duì)切片進(jìn)行染色,濕盒中室溫孵育過夜,然后使用改良標(biāo)記的抗生物素-生物素試劑結(jié)合抗體20 min,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌5 min,將新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)液滴加在切片上,使切片顯色,用蒸餾水沖洗切片以終止顯色,然后用蘇木素染液再次染色5～10 min,最后用中性樹膠封片。封片后立即拍照,在每張切片中隨機(jī)選取5個(gè)視野圖像,采用圖像分析軟件IPP6.0(Image Pro-Plus,IPP6.0)測(cè)量其中陽性染色顆粒相對(duì)含量。按照染色陽性細(xì)胞所占比例分為陰性(0%～5%)、輕度(6%～25%)、中度(26%～50%)和重度(51%～100%)表達(dá)[11]。以血管瘤組織作為陽性對(duì)照,通過從染色程序中省略一抗染色步驟制備陰性對(duì)照玻片。陽性對(duì)照是為了排除假陰性結(jié)果;陰性對(duì)照是為了排除陽性結(jié)果是否存在內(nèi)源性生物素、內(nèi)源性過氧化物酶和其他非特異性著色。

2 結(jié)果

2.1兩組血清vWF表達(dá)水平比較 銀屑病組血清vWF表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(21.31±3.04)ng/L vs(15.72±1.94)ng/L;t=8.490,P<0.001]。

2.2兩組免疫組化染色結(jié)果比較 在皮膚的表皮部位以及真皮部位的炎癥細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中,銀屑病組的vWF表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組更高,中、重度表達(dá)占比更大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。銀屑病患者皮膚組織免疫組化染色所見見圖1。

?表皮和真皮中內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞的vWF呈輕度表達(dá);?表皮和真皮中內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞的vWF呈中度表達(dá);?表皮和真皮中內(nèi)皮細(xì)胞的vWF呈重度表達(dá)

表1 兩組表皮和真皮組織中vWF表達(dá)強(qiáng)度比較[n(%)]

2.3銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平與PASI評(píng)分的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平與PASI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.432,P=0.009)。見圖2。

圖2 銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平與PASI評(píng)分的散點(diǎn)圖

2.4銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平與組織vWF表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 單因素方差分析結(jié)果顯示,銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平與真皮和表皮中vWF的表達(dá)強(qiáng)度無顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表2。

表2 銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平與組織vWF表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果

3 討論

3.1目前,不少文獻(xiàn)報(bào)道了銀屑病和凝血病之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)銀屑病的凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)存在異常[12]。vWF被認(rèn)為是內(nèi)皮功能障礙和損傷的標(biāo)志物,血清vWF水平升高反映了內(nèi)皮細(xì)胞損傷[13],同時(shí)該指標(biāo)也是血栓形成和動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)增加的指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示,銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。Batycka-Baran等[15]的研究結(jié)果也顯示,相比于對(duì)照組,銀屑病患者血清vWF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1和可溶性E選擇素水平均顯著升高,且與循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn),越來越多的內(nèi)皮細(xì)胞被認(rèn)為是內(nèi)皮損傷和功能障礙的標(biāo)志物[16]。

3.2有研究指出,銀屑病患者存在亞臨床消耗性凝血病[17-18],血小板消耗量增加導(dǎo)致未成熟血小板從骨髓釋放到循環(huán)血液中。馮雷等[19]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn),其結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀屑病患者平均血小板體積增加。而約10%的循環(huán)vWF來源于血小板α顆粒,這也解釋了銀屑病患者vWF表達(dá)水平升高的原因。本研究結(jié)果顯示,銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平與PASI評(píng)分呈正相關(guān)。Skoie等[20]的研究結(jié)果表明銀屑病患者血清的同型半胱氨酸和C反應(yīng)蛋白水平高于健康受試者,并與PASI評(píng)分呈正相關(guān),但未評(píng)價(jià)其與vWF表達(dá)水平的關(guān)系。Anyfanti等[21]的研究也發(fā)現(xiàn),心血管風(fēng)險(xiǎn)增加與銀屑病患者PASI評(píng)分嚴(yán)重程度相關(guān)。由于銀屑病是一種全身炎癥性疾病,因此機(jī)體的全身炎癥和內(nèi)皮功能障礙發(fā)生可能較皮膚相關(guān)因子的表達(dá)更能影響血清不同炎癥標(biāo)志物的水平。本研究中銀屑病組表皮vWF表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組顯著上調(diào)。但Sankar等[22]的研究結(jié)果顯示,銀屑病患者和對(duì)照組表皮表達(dá)強(qiáng)度均較弱,兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果之間的差異可能是由于樣本量、銀屑病皮膚組織取材部位或免疫組化染色程序差異所致。本研究中,銀屑病組真皮中內(nèi)皮細(xì)胞vWF表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組顯著上調(diào),這與Lee等[23]的研究結(jié)果相似。該研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者血管平均表面(vWF陽性)較對(duì)照組增加1倍。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)銀屑病組真皮炎性細(xì)胞中vWF表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組顯著上調(diào)。Rashed等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)銀屑病患者真皮炎癥細(xì)胞中血管生成生長(zhǎng)因子表達(dá)高于對(duì)照組,這可能反映了血管反應(yīng)和炎癥之間的相互作用。

3.3在本研究中,銀屑病患者皮膚vWF表達(dá)強(qiáng)度與血清vWF表達(dá)水平無顯著關(guān)聯(lián),這可能是由于循環(huán)vWF的來源(主要為系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞和循環(huán)血小板)不同于依賴于局部?jī)?nèi)皮功能障礙的皮膚vWF表達(dá)。但也有研究報(bào)道顯示,銀屑病患者血清和皮膚組織中血管生成因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平高于對(duì)照組,但血清和皮膚中的表達(dá)水平無顯著關(guān)聯(lián)[25],這與本研究是一致的。

綜上所述,銀屑病患者血清vWF表達(dá)水平升高,且與PASI評(píng)分呈正相關(guān),此因子可能在銀屑病的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用,有成為銀屑病治療靶點(diǎn)的應(yīng)用潛力,研究結(jié)論有待通過大樣本量的多中心研究加以驗(yàn)證。