溫健文,劉 建,張介霞,李玉紅,陳維聰,詹力揚(yáng),吳 曼,葉旺旺

(自然資源部第三海洋研究所、海洋大氣化學(xué)與全球變化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門(mén)361005)

甲烷(CH4)在百年尺度的溫室潛力上是二氧化碳的32倍[1],貢獻(xiàn)了20%的溫室效應(yīng)。自工業(yè)革命以來(lái),它們?cè)诖髿庵械臐舛妊杆僭黾樱航刂?021年,大氣中甲烷濃度為1 893 nmol/mol。甲烷通過(guò)參與對(duì)流層臭氧和羥基的光化學(xué)調(diào)節(jié)以及平流層水分子的形成[2],積極參與大氣化學(xué)循環(huán)進(jìn)而間接影響全球氣候。海洋被認(rèn)為是大氣中甲烷的凈來(lái)源,盡管僅占全球甲烷排放的2%[3],但是受陸源輸入、水深較淺和上層海水通風(fēng)等原因的影響,河口近海區(qū)域占全球海洋甲烷總排放量的75%[4],是甲烷的活躍區(qū)域。

富含氧氣的表層海水理論上不利于甲烷產(chǎn)生,然而世界上大多數(shù)海域的表層海水甲烷濃度相對(duì)于大氣都是過(guò)飽和的,這種現(xiàn)象稱(chēng)為海洋甲烷悖論[5]。近年來(lái)的研究表明含甲基的有機(jī)物是甲烷產(chǎn)生的潛在前體物質(zhì)[6-7]。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者對(duì)現(xiàn)有的甲烷悖論產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行了梳理[8-9],現(xiàn)場(chǎng)受控培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)也表明向海水中添加甲基膦酸(MPn)[10-11]、二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽(DMSP)[12-14]和三甲胺(TMA)[15-18]等含甲基的物質(zhì)可以促進(jìn)甲烷產(chǎn)生。最新的研究表明所有生物體在胞內(nèi)都可以進(jìn)行由活性氧驅(qū)動(dòng)的甲烷生成,表明該過(guò)程可能是除傳統(tǒng)認(rèn)為的甲烷厭氧產(chǎn)生外存在的另一種甲烷產(chǎn)生途徑[19]。

陸豐近海和九龍江河口作為亞熱帶近海的典型水域,受人為影響較大。九龍江是中國(guó)東南部一條中等規(guī)模的亞熱帶河流,大部分降雨發(fā)生在春夏兩季。在過(guò)去的30年,受人為干擾的影響(如畜牧業(yè)和人為廢棄物的排放等),流域水體的營(yíng)養(yǎng)鹽含量較高[20]。另外,九龍江河口上游段的溶解有機(jī)碳約為下游段的4～6倍[21]。目前,已有學(xué)者對(duì)九龍江河口和珠江口溫室氣體的分布和通量進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)九龍江河口水體是大氣甲烷的強(qiáng)源[22],渦流驅(qū)動(dòng)的珠江口羽流對(duì)甲烷分布有重要的影響[23]。然而,目前這兩個(gè)水域溶存甲烷的產(chǎn)生和消耗過(guò)程及其主要影響因子還不清晰。本研究擬在前人研究基礎(chǔ)上[24-25],對(duì)九龍江河口和陸豐近海水體進(jìn)行受控培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)并分析溫室氣體產(chǎn)生速率,以更好地了解甲烷在不同營(yíng)養(yǎng)鹽環(huán)境下的產(chǎn)生潛力。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2021年在九龍江河口(6月)和陸豐近海(8月)進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)采樣和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),其他室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在航次結(jié)束后的1個(gè)月內(nèi)完成。九龍江河口的樣品采集于潮汐作用較強(qiáng)的中游流域(玉枕洲南側(cè)水道,24.42°N,117.87°E)。由于高低潮之間表層海水的鹽度變化較大(9.5),且已有研究表明該區(qū)域溫室氣體濃度變化與鹽度變化呈負(fù)相關(guān)[26],因此該站位是研究河口溫室氣體受潮汐影響變化的典型區(qū)域。陸豐近海的采樣站位位于陸豐市甲子港的南側(cè)(22.51°N,116.12°E),是珠江口羽流中心。兩個(gè)采樣站位之間相距236 km,采樣時(shí)使用有機(jī)玻璃采水器,通過(guò)繩吊的方法采集表層海水(水面以下0.5 m)。在每次實(shí)驗(yàn)之前,將海水轉(zhuǎn)移到預(yù)先酸洗的聚碳酸酯容器(25 L)中,然后使用蠕動(dòng)泵定量往3 L無(wú)菌氣袋(Tedar PVF采樣袋,大連德霖氣體包裝有限公司)中注入1 L海水。隨后在各個(gè)袋中添加相應(yīng)的試劑(表1)：葡萄糖(碳源,C)、亞硝酸鹽(氮源,N)、MPn、DMSP、TMA。實(shí)驗(yàn)分3個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行,其中實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)3的對(duì)照(Control)組不做任何處理;實(shí)驗(yàn)2的過(guò)濾(filtered)樣品(C+N)組和(C+N+MPn)組依次使用0.45 μm和0.22 μm的一次性針頭濾器配套蠕動(dòng)泵進(jìn)行抽濾(流速控制在200 mL/min),以盡量降低過(guò)濾對(duì)溶解氣體的影響。氣袋需要把空氣排盡,并在實(shí)驗(yàn)室外露天放置培養(yǎng),實(shí)現(xiàn)晝夜更替的效果,盡量模擬原位條件。

表1 九龍江河口和陸豐近海培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的試劑添加情況Tab.1 Addition of reagents in incubation experiments in Jiulongjiang Estuary and Lufeng offshore

對(duì)于上述的樣品,在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始、實(shí)驗(yàn)正好滿(mǎn)2、4、6 d時(shí)的固定時(shí)間節(jié)點(diǎn)上分別進(jìn)行采樣。采集海水樣品時(shí)首先采集溶解氧樣品,然后采集甲烷分析樣品,轉(zhuǎn)移氣袋樣品到瓶口涂有油脂的20.0 mL頂空玻璃瓶中,并加入飽和氯化汞溶液0.1 mL以抑制微生物活動(dòng),使用丁基橡膠隔膜和鋁蓋密封。每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)均采集雙樣進(jìn)行分析,采樣結(jié)束后將樣品置于避光環(huán)境下保存。

1.2 樣品分析方法

本研究按照靜態(tài)頂空分析方法對(duì)水體樣品中的甲烷進(jìn)行分析[27],該方法的準(zhǔn)確度和精密度均在2%以?xún)?nèi)。用濃度為1.00 μmol/mol甲烷的標(biāo)準(zhǔn)氣體(中國(guó)計(jì)量科學(xué)院國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心,成分為氮?dú)鉃榈讱獾募淄闃?biāo)氣)進(jìn)行頂空處理。頂空置換出12.4 mL海水樣品,經(jīng)45 ℃恒溫振蕩后,抽取1.0 mL頂空氣進(jìn)入氣相色譜儀(日本島津,型號(hào)：GC-2000)分析。實(shí)驗(yàn)采用測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)水樣的方法來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)水樣是預(yù)先添加氯化汞并在25 ℃的恒溫水浴槽中鼓氣與空氣達(dá)到平衡時(shí)(大于48 h)的超純水。隨后,分別使用高純氮?dú)?精度在99.999%以上)、4.00 、6.00、8.00、12.00、16.00 μmol/mol的甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣體進(jìn)行頂空。標(biāo)準(zhǔn)水樣的頂空體積、頂空氣的測(cè)定方法與測(cè)定樣品時(shí)一致。在樣品分析過(guò)程中,通過(guò)每隔2～3 h重復(fù)測(cè)定同一標(biāo)準(zhǔn)氣體頂空(4.00 μmol/mol甲烷)的標(biāo)準(zhǔn)水樣濃度來(lái)校正氣相色譜的基線漂移。

溫度和鹽度使用便攜電導(dǎo)率儀(德國(guó)WTW,型號(hào)：Cond3110)測(cè)定。溶解氧濃度使用溶氧探頭(賽默飛,型號(hào)：STARA3235)測(cè)定。營(yíng)養(yǎng)鹽使用AA3型流動(dòng)注射分析儀(德國(guó)SEAL,型號(hào)：AA3)進(jìn)行分析,其測(cè)定方法分別為：亞硝酸鹽濃度采用萘乙二胺分光光度法測(cè)定,磷酸鹽濃度采用磷鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定,硝酸鹽濃度采用銅鎘柱還原法測(cè)定[28],銨鹽濃度采用靛酚藍(lán)分光光度法測(cè)定[29],檢出限分別為0.02、0.02、0.05、0.16 μmol/L。本研究對(duì)于不同組別的溫室氣體濃度和環(huán)境參數(shù)(溫度、鹽度、溶解氧和營(yíng)養(yǎng)鹽)的對(duì)比分析主要采用比較平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸豐近海和九龍江河口的水體性質(zhì)

表2中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)采樣區(qū)域的溫度和溶解氧濃度相似：由于緯度差異較小,因此溫度相似;溶解氧濃度基本都處于與大氣平衡的狀態(tài)。不同的是,兩個(gè)采樣站位的總無(wú)機(jī)氮濃度相差3個(gè)數(shù)量級(jí)。其中,陸豐近海站位水體鹽度較高,以海水為主,在實(shí)驗(yàn)室測(cè)得硝酸鹽和磷酸鹽濃度均在檢出限以下(總無(wú)機(jī)氮濃度為0.6 μmol/L),屬于貧營(yíng)養(yǎng)化水體;而九龍江河口采樣站位水體以低鹽度和高營(yíng)養(yǎng)鹽的海水為主,其硝酸鹽濃度高達(dá)309.7 μmol/L、總無(wú)機(jī)氮濃度為351.4 μmol/L、磷酸鹽濃度為2.4 μmol/L,屬于富營(yíng)養(yǎng)化水體。

表2 九龍江河口和陸豐近海水文參數(shù)的范圍和平均值Tab.2 Range and average value of hydrological parameters of Jiulongjiang Estuary and Lufeng offshore

2.2 陸豐近海貧營(yíng)養(yǎng)化水體中甲烷培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

在陸豐近海的水體培養(yǎng)中(實(shí)驗(yàn)1),(C+N+MPn)組水體中的甲烷濃度與其余四組相比發(fā)生了明顯變化。在培養(yǎng)的0～2 d,(C+N+MPn)組的甲烷濃度增加了2個(gè)數(shù)量級(jí)(378.0 nmol/L);甲烷增長(zhǎng)速率為183.9 nmol/(L·d)[圖1(a)]。在2～4 d的培養(yǎng)過(guò)程中,甲烷濃度增加到了444.0 nmol/L,比前兩天增加了17.4%,增長(zhǎng)速率為33.0 nmol/(L·d)。在4～6 d培養(yǎng)過(guò)程中,甲烷濃度降低到398.0 nmol/L,增長(zhǎng)速率為-23.0 nmol/(L·d),相比于2～4 d時(shí)的最高值減少了10.4%。其他四組甲烷濃度的增長(zhǎng)幅度在-6.7～16.0 nmol/L之間,增長(zhǎng)速率在-1.0～8.9 nmol/(L·d)之間,與(C+N+MPn)組的變化相比可以忽略不計(jì)。同時(shí),在0～2 d內(nèi),(C+N+MPn)組的溶解氧濃度變化和變化速率是各組中最大的,從284.4 μmol/L下降到257.8 μmol/L,變化幅度為-9.4%,變化速率為-13.3 μmol/(L·d)[圖1(b)]。

圖1 陸豐近海水體各參數(shù)濃度變化Fig.1 Concentration changes of some parameters in Lufeng offshore(a)為實(shí)驗(yàn)1的甲烷濃度變化,(b)為實(shí)驗(yàn)1的溶解氧濃度變化,(c)為實(shí)驗(yàn)2的甲烷濃度變化。

在實(shí)驗(yàn)2中,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始2 d,(Not filtered+C+N+MPn)組的甲烷濃度為653.1 nmol/L,比實(shí)驗(yàn)1同時(shí)期的甲烷濃度高72.7%,增長(zhǎng)速率也是各組中的最高值,為320.2 nmol/(L·d)(比實(shí)驗(yàn)1的速率高69.3%)[圖1(c)]。雖然發(fā)現(xiàn)甲烷濃度的增長(zhǎng)幅度和增長(zhǎng)速率都比實(shí)驗(yàn)1的更高,但是隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,在2～6 d甲烷消耗速率與實(shí)驗(yàn)1的相似,如2～4 d和4～6 d的增長(zhǎng)速率分別是-23.3 nmol/(L·d)和-27.4 nmol/(L·d)。而(Filtered+C+N+MPn)組也觀測(cè)到略高于(Not filtered+C+N+MPn)組的甲烷濃度,可能受到了光降解的影響[30]。

2.3 九龍江河口富營(yíng)養(yǎng)化水體中甲烷培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

在九龍江河口水體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中(實(shí)驗(yàn)3),0～2 d內(nèi)甲烷生產(chǎn)速率最高,分別為(C+N+DMSP)組2.2 nmol/(L·d)、(C+N+MPn)組10.1 nmol/(L·d)和(C+N+TMA)組1.9 nmol/(L·d)。同時(shí),甲烷濃度在實(shí)驗(yàn)2 d時(shí)也達(dá)到了最大值,分別為13.7、29.4、13.4 nmol/L[圖2(a)]。這可能是由于碳源、氮源和含甲基有機(jī)物(MPn、DMSP和TMA)的添加,使得九龍江河口的微生物可以獲得足夠的底物去生產(chǎn)甲烷。其中,(C+N+MPn)組的增長(zhǎng)率最高,達(dá)到了211%,比(C+N+DMSP)組和(C+N+TMA)組高5倍。該結(jié)果表明九龍江河口可能存在多種基于甲基分解產(chǎn)生甲烷的路徑,其中基于MPn路徑的微生物最活躍。同時(shí),(C+N+DMSP)組、(C+N+MPn)組和(C+N+TMA)組的溶解氧濃度也是在培養(yǎng)0～2 d下降最多,分別是-22.9%、-21.0%和-22.0%[圖2(b)]。在2～6 d,隨著原有底物的耗盡,甲烷的生產(chǎn)速率逐漸小于甲烷的消耗速率,總體上體現(xiàn)為甲烷的消耗。Control組和(C+N)組甲烷濃度在0～2 d沒(méi)有增長(zhǎng),但在2～4 d存在甲烷濃度輕微波動(dòng),表明水體中可能存在甲烷厭氧產(chǎn)生和甲烷氧化。綜上,九龍江河口水體也存在基于MPn、DMSP和TMA路徑生產(chǎn)甲烷的路徑,但是基于MPn路徑生產(chǎn)的甲烷更多。

3 討論

通過(guò)水體受控培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)貧營(yíng)養(yǎng)化水體(陸豐近海)在底物充足(如MPn)、無(wú)機(jī)磷匱乏的條件下能夠比富營(yíng)養(yǎng)化水體(九龍江河口)產(chǎn)生更多的甲烷(陸豐近海甲烷濃度和甲烷生成速率約是九龍江口的22倍和87倍),說(shuō)明陸豐近海水體中基于MPn路徑生產(chǎn)甲烷的微生物對(duì)添加的有機(jī)磷和營(yíng)養(yǎng)鹽更加敏感。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)(C+N+MPn)組和(Filtered+C+N+MPn)組的甲烷增加量前者(640.0 nmol/L)是后者(4.4 nmol/L)的近145倍[圖1(c)],即在加入相同底物量的情況下,兩者的甲烷產(chǎn)量差異明顯,說(shuō)明甲烷產(chǎn)生可能是微生物新陳代謝的結(jié)果。這可能主要與磷的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制有關(guān)：九龍江河口的無(wú)機(jī)磷和實(shí)驗(yàn)所添加的MPn(有機(jī)物)同為底質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物,微生物在營(yíng)養(yǎng)鹽的刺激下可能會(huì)同時(shí)利用無(wú)機(jī)磷和MPn,但無(wú)機(jī)磷的存在在一定程度上抑制了微生物的MPn利用率,因此其副產(chǎn)物甲烷也相應(yīng)減少。與此相反的是,陸豐近海在無(wú)機(jī)磷匱乏的情況下,微生物可能利用MPn來(lái)補(bǔ)充自身新陳代謝所需的磷源,由此造成更多的甲烷釋放。先前的研究表明,富氧水體中的原位甲烷生產(chǎn)可能是近海甲烷的重要來(lái)源[24,31-32]。盡管其潛在機(jī)制仍然模糊不清,但已有研究表明添加MPn會(huì)增加沿海水域的甲烷產(chǎn)量[24]。添加的碳源和氮源可能有助于創(chuàng)造一個(gè)缺磷的環(huán)境,刺激需磷微生物的生長(zhǎng);或者微生物分解MPn的過(guò)程同時(shí)需要碳源和氮源的供給。因此,微生物介導(dǎo)的MPn分解和甲烷產(chǎn)生將依賴(lài)于水體中的營(yíng)養(yǎng)鹽水平,表明貧營(yíng)養(yǎng)化水體可能是甲烷有氧產(chǎn)生的重要場(chǎng)所。

甲烷生產(chǎn)速率峰值都發(fā)生在培養(yǎng)過(guò)程的前兩天,這可能與微生物群落更替有關(guān)[圖1(a)、(c)]。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段(0～2 d),充足的MPn被迅速消耗并產(chǎn)生大量甲烷。溶解氧的降低速率最大值同樣出現(xiàn)在前兩天也印證了該觀點(diǎn)[圖1(b)]。隨后(2～4 d),MPn的濃度迅速下降,以至于不能維持更高的甲烷產(chǎn)生。同時(shí),由于甲烷濃度升高,可能會(huì)提升甲烷氧化速率。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加(4～6 d),甲烷會(huì)被持續(xù)消耗直到降到甲烷可以被氧化的閾值之內(nèi),從而保持穩(wěn)定。因此,在添加碳源、氮源和MPn的0～2 d內(nèi),推測(cè)陸豐近海水體的微生物活動(dòng)最活躍,通過(guò)微生物新陳代謝過(guò)程分解MPn產(chǎn)生甲烷的速率和溶解氧的消耗也最高。

綜上,推測(cè)貧營(yíng)養(yǎng)化的陸豐近海水體中存在基于MPn路徑生產(chǎn)甲烷的微生物,在條件適宜的情況(如充足的碳源和氮源)下可以生產(chǎn)甲烷。

4 結(jié)論

根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)和室內(nèi)受控培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),可以得出以下主要結(jié)論：

(1)陸豐近海水體中添加碳源、氮源和MPn會(huì)導(dǎo)致大量甲烷產(chǎn)生(比對(duì)照組高兩個(gè)數(shù)量級(jí)),表明陸豐近海水體中存在基于MPn路徑生產(chǎn)甲烷的過(guò)程。

(2)九龍江河口水體也存在基于MPn、DMSP和TMA路徑生產(chǎn)甲烷的過(guò)程,但基于MPn路徑生產(chǎn)的甲烷最多。

(3)通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)同樣受控培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件下,陸豐近海通過(guò)MPn產(chǎn)生的甲烷濃度最高值是九龍江河口的約22倍,其甲烷生成速率是九龍江河口的約87倍。營(yíng)養(yǎng)鹽條件的差異可能是造成該結(jié)果的主要因素。其中,貧營(yíng)養(yǎng)化水體可能更有利于基于MPn路徑的甲烷產(chǎn)生。由此推斷,寡營(yíng)養(yǎng)的開(kāi)闊大洋表層海水可能是甲烷有氧產(chǎn)生的重要場(chǎng)所。

致謝：感謝自然資源部第三海洋研究所海洋與海岸地質(zhì)研究室王愛(ài)軍老師和海洋生物與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室顧海峰老師提供的營(yíng)養(yǎng)鹽、溫度和鹽度數(shù)據(jù)。感謝中國(guó)海監(jiān)203船全體科考隊(duì)員和船員在出海方面提供的幫助。