賴慶娜,王 路,陳建明

(閩江學(xué)院、福建省海洋生物多樣性保護(hù)與永續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350108)

免疫熒光標(biāo)記技術(shù)(Immunofluorescence Labeling Technology)是抗原-抗體反應(yīng)與熒光素標(biāo)記技術(shù)結(jié)合,用于檢測(cè)抗原或抗體的方法,在熒光顯微鏡下,可以直接觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原-抗體復(fù)合物及其存在的位置[1]。為了能夠更加完好的保存抗原的免疫活性,常采用冰凍切片的方法對(duì)組織進(jìn)行切片處理[2]。目前免疫熒光標(biāo)記與冷凍切片技術(shù)的聯(lián)合使用已經(jīng)較為廣泛和成熟,尤其是應(yīng)用在活體熒光、脂質(zhì)的表達(dá)和細(xì)胞膜抗原等方面[3]。然而,在組織切片中,自體熒光(autofluorescence,AF)常常干擾特定熒光信號(hào)的檢測(cè),已成為干擾免疫熒光染色和數(shù)據(jù)分析的常見(jiàn)問(wèn)題。自體熒光是由于內(nèi)部組織成分或外部處理導(dǎo)致組織在廣泛的激發(fā)和發(fā)射光譜中自然發(fā)出的熒光,是組織或細(xì)胞樣本在熒光檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生的與目的信號(hào)無(wú)關(guān)的背景熒光信號(hào)[4]。有些機(jī)體能夠自然發(fā)出多個(gè)波長(zhǎng)的熒光,跨越許多常用熒光報(bào)告物的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜,包括抗體、染料、著色劑、探針和轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì),使得特異性熒光和自體熒光很難被區(qū)分[5]。

珊瑚綱作為腔腸動(dòng)物中最大的一個(gè)綱,具備先天免疫能力,對(duì)環(huán)境變化和壓力脅迫具有一定的抗逆性,可通過(guò)復(fù)雜的細(xì)胞識(shí)別系統(tǒng)識(shí)別非自我組分并啟動(dòng)下游信號(hào)通路,最終產(chǎn)生免疫反應(yīng),如吞噬作用、凝血反應(yīng)和抗菌防御等[6]。因此珊瑚是研究腔腸動(dòng)物乃至無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)的良好研究對(duì)象。珊瑚自體熒光來(lái)源主要包括共生蟲(chóng)黃藻(Symbiodinium)葉綠素、自身攜帶的熒光蛋白及其他衍生物產(chǎn)生的背景熒光[7-8]。蟲(chóng)黃藻葉綠素的激發(fā)光譜為488 nm,發(fā)射光譜為650～690 nm[9],較易激發(fā)自體熒光,這顯著影響了珊瑚在免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中對(duì)特異性熒光的判斷,而最簡(jiǎn)單有效的方法是通過(guò)避免激發(fā)自體熒光來(lái)減少非特異熒光的產(chǎn)生[10],但是目前在免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中很少有體外熒光基團(tuán)能夠提供與自發(fā)熒光基團(tuán)完全不同的發(fā)射光譜[11]。這就限制了珊瑚冰凍切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)效果,干擾抗體標(biāo)記的目的蛋白熒光的觀察[12]。

圍繞這個(gè)問(wèn)題,本研究以花傘軟珊瑚(Xeniasp.)為研究對(duì)象,此種珊瑚因其快速的生長(zhǎng)能力及高質(zhì)量的基因組而廣受關(guān)注,被認(rèn)為是研究生態(tài)環(huán)境的良好模式生物[13]。此種珊瑚據(jù)研究并不含有熒光蛋白[14],但是仍存在明顯的自體熒光,并且目前針對(duì)軟珊瑚自體熒光的淬滅尚未查找到相關(guān)報(bào)道。已有的珊瑚免疫熒光實(shí)驗(yàn)中常采用酒精脫水的方法去除自體熒光[15],不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且對(duì)于花傘軟珊瑚自體熒光淬滅效果較差。本研究首次嘗試在花傘軟珊瑚冰凍切片免疫熒光染色中,使用一種在小鼠和人體組織切片中常用的TrueBlack Lipofuscin自體熒光淬滅劑[16-17](下文簡(jiǎn)稱TrueBlack),并與已有研究中的酒精梯度脫水法進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)TrueBlack可以去除花傘軟珊瑚自身以及蟲(chóng)黃藻葉綠素在內(nèi)所產(chǎn)生的自發(fā)熒光,有效消除免疫熒光實(shí)驗(yàn)中的自體熒光干擾。本研究可為珊瑚后續(xù)的機(jī)理研究以及腔腸動(dòng)物的研究提供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 珊瑚的培養(yǎng)

將花傘軟珊瑚培養(yǎng)于循環(huán)海水水族箱中,設(shè)置水族箱中的海水溫度為(25±1) ℃,鹽度為32～35,pH=8.1。珊瑚養(yǎng)殖使用HQI-10000K金屬鹵化物燈(BLV-Nepturion)提供有效光輻射強(qiáng)度(PAR)180 μmol/(m2·s),光暗周期為12 h∶12 h[18]。

1.2 免疫組化切片染色

將珊瑚水螅體置于4%(體積分?jǐn)?shù),下同)的多聚甲醛中4 ℃過(guò)夜固定,PBST緩沖液清洗3次。將珊瑚組織塊置于OTC中包埋,然后用冰凍切片機(jī)切片,切片厚度為6 μm。冰凍切片由PBS緩沖液清洗3次。0.25%Triton-X滲透10 min后再用PBS緩沖液清洗3次。用70%酒精將TrueBlack(cat：23007,Biotium)稀釋成20×的工作液,將組織切片放置于TrueBlack工作液中孵育2～5 min后用PBS緩沖液清洗3次。組織切片在常溫下用GB緩沖液封閉1 h[GB緩沖液：PBS;10%山羊血清;10% BSA;10 mmol/L NaN3]后,一抗[包括Lamp2a(cat：18528,abcam)、DM1a(cat：7291,abcam)、Tgn38(cat：166594,santacruze),使用GB緩沖液按1∶500(體積比,下同)稀釋]4 ℃下避光孵育24 h。再用PBS緩沖液清洗3次。二抗[包括鼠抗(cat：S0100,蘭博利德)和兔抗(cat：S0101,蘭博利德)]使用TBS按1∶1 000稀釋。常溫孵育1 h后再用PBS緩沖液清洗3次。DAPI(工作液濃度為0.5 μg/ml)染色10 min,用PBS緩沖液清洗3次。最后用80%甘油封片,激光共聚焦顯微鏡SP8(Leica,德國(guó))拍片。

1.3 酒精梯度脫水法

切片滲透處理后進(jìn)行逐步洗脫,洗脫步驟和順序如下：首先用50%酒精浸泡2 h,然后用70%酒精4 ℃過(guò)夜,再用95%酒精浸泡20 min,最后用100%酒精浸泡20 min。酒精脫水后用PBS緩沖液清洗后封片拍片[13]。

1.4 蛋白提取

用液氮研磨樣品至粉末狀(樣品重量約0.1～0.2 g),用1 mL TRIzol快速覆蓋冷粉末,添加研磨珠并在4 ℃下漩渦10～20 min。向樣品中加入總體積1/5的氯仿,用力搖晃樣品1 min,室溫下靜置5 min。4 ℃下,10 000 r/min旋轉(zhuǎn)樣品15 min。去除剩余的RNA水相。向剩余的有機(jī)層中添加0.3 mL 100%酒精,混勻樣品,并在室溫下放置2～3 min。4 ℃下4 000 r/min離心樣品1 min沉淀DNA,取上清液加入1.5 mL異丙醇沉淀蛋白質(zhì),將樣品在室溫下放置10 min。在4 ℃下,將樣品10 000 r/min離心10 min。去除上清液,并用0.3 mol/L鹽酸胍溶液洗滌蛋白質(zhì)顆粒兩次。然后在4 ℃下離心5 min。用95%酒精加2.5%甘油混合液洗滌蛋白質(zhì)兩次。蛋白顆粒風(fēng)干不超過(guò)10 min后將其溶解在樣品緩沖液[2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) SDS、2% 2-巰基乙醇、10%甘油、0.062 5 mol/L Tris-HCl、pH=6.8]中。

1.5 Western blot方法

收集到的蛋白樣品,用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(B5000-500T,蘭博利德)測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。電泳濃縮膠時(shí)使用低電壓(80 V)恒壓電泳,而在溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)使用高電壓(120 V)恒壓電泳。溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。浸潤(rùn)和活化PVDF膜,設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300～400 mA,轉(zhuǎn)膜30～60 min。轉(zhuǎn)膜完畢后,立即把蛋白膜放置到預(yù)先加入的Western洗滌液中,漂洗1～2 min,以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。加入Western封閉液,在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60 min。去除封閉液,立即加入稀釋好的一抗,4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。去除一抗后,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4 ℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育1 h。ECL(enhanced chemiluminescence)顯影,檢測(cè)蛋白。

1.6 熒光強(qiáng)度計(jì)算方法和數(shù)據(jù)處理

使用萊卡SP8軟件計(jì)算每一張切片的熒光強(qiáng)度。P<0.05表示具有差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 TrueBlack消除自體熒光效果

本研究首先嘗試使用TrueBlack孵育,與傳統(tǒng)酒精脫水的方法比較兩種方法去除自體熒光的效果。圖1為本研究中所使用的花傘軟珊瑚明場(chǎng)下的放大圖。圖2為各熒光通道下TrueBlack法與酒精脫水法處理的珊瑚冰凍切片自體熒光去除效果比較。如圖2所示,對(duì)照組在任何通道中都存在明顯的自體熒光,在Cy5中可以清楚地觀察到蟲(chóng)黃藻葉綠素產(chǎn)生的自發(fā)熒光。對(duì)每張切片采集5個(gè)視野,對(duì)圖片進(jìn)行自發(fā)熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì),結(jié)果如圖3所示。酒精處理組和對(duì)照組相比,自體熒光有一定程度降低,酒精處理組各通道檢測(cè)到的自體熒光強(qiáng)度平均值比對(duì)照組低57.2%(DAPI：57%,FITC：44.5%,RHOD：52.3%,TRed：81.4 %,Cy5：50.9%),但是仍可以明顯觀察到蟲(chóng)黃藻葉綠素自發(fā)熒光(圖2中箭頭指向部分)。與對(duì)照組和酒精處理組相比,TrueBlack處理組各通道檢測(cè)到的自體熒光強(qiáng)度平均值比酒精處理組低52.4%(DAPI：50.7%,FITC：49.5%,RHOD：50.0%,TRed：52.2%,Cy5：59.6%),檢測(cè)到的樣品自體熒光最少,并且TrueBlack處理后,在不同通道下幾乎檢查不到蟲(chóng)黃藻葉綠素的熒光信號(hào)。由此判斷,現(xiàn)有的珊瑚免疫組化研究中常采用的酒精脫水方法,并不能高效去除花傘軟珊瑚的自體熒光,而使用TrueBlack處理樣品則可顯著消除花傘軟珊瑚冰凍切片自體熒光。

圖3 各熒光通道下TrueBlack法與酒精脫水法處理的珊瑚冰凍切片自體熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)Fig.3 Autofluorescence intensity statistics of coral frozen sections treated with TrueBlack method and alcohol dehydration method under different fluorescence channelsP<0.05。

2.2 TrueBlack對(duì)特異性免疫熒光標(biāo)記的影響

冰凍切片通過(guò)熒光標(biāo)記對(duì)樣品中待測(cè)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位和定量檢測(cè),因此需要探究TrueBlack是否會(huì)影響冰凍切片特異性免疫熒光標(biāo)記。由于二抗普遍存在非特異性熒光干擾的情況[19],所以首先排除二抗非特異性熒光干擾。將軟珊瑚冰凍切片滲透處理后TrueBlack孵育5 min,實(shí)驗(yàn)組分別由羊抗鼠(S0100)和羊抗兔(S0101)二抗孵育處理,對(duì)照組僅用配置羊抗鼠和羊抗兔的TBS緩沖液孵育處理(圖4),對(duì)每張切片采集5個(gè)視野,對(duì)圖片進(jìn)行自發(fā)熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)(圖5)。從圖4和圖5可以看出在各通道下實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的熒光強(qiáng)度無(wú)顯著差異,可排除二抗的非特異性干擾,同時(shí)在兩個(gè)信號(hào)通路中,發(fā)現(xiàn)Cy5通道對(duì)二抗非特異性熒光的去除效果最好。另外珊瑚熒光蛋白的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜如表1[20]所示,Cy5通道的激發(fā)光譜波段為630～650 nm,發(fā)射光譜波段為660～670 nm,這兩個(gè)波段和表1中珊瑚熒光蛋白的激發(fā)光譜錯(cuò)開(kāi),對(duì)于其他珊瑚而言,Cy5通道還可能避免珊瑚熒光蛋白自體熒光的干擾。

表1 珊瑚熒光蛋白的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜Tab.1 Excitation and emission spectra of coral fluorescent protein

圖5 二抗對(duì)TrueBlack處理的珊瑚冰凍切片的自體熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistics of the second antibody on the autofluorescence intensities of TrueBlack treated coral frozen sections P<0.05。

排除二抗非特異性熒光干擾后,選擇3個(gè)對(duì)花傘軟珊瑚特異性較強(qiáng)的一抗標(biāo)記[Lamp2a、DM1a、Tgn38],對(duì)照組只做了DAPI處理,不做抗體處理,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在染料或者抗體處理之前都經(jīng)過(guò)TrueBlack孵育5 min。從圖6可以發(fā)現(xiàn),3個(gè)實(shí)驗(yàn)組背景熒光和自體熒光基本去除。對(duì)每張切片采集5個(gè)視野,對(duì)圖片進(jìn)行自發(fā)熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì),其結(jié)果如圖7所示,特異性熒光信號(hào)強(qiáng)度平均高于對(duì)照組205.3%,其中Lamp2a高出128.6%,DM1a高出304.3%,Tgn38高出183%。為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組中一抗和二抗為特異性標(biāo)記,如圖8所示,取這3種蛋白做Western blot驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)表明本研究中的抗體與抗原為特異性結(jié)合,免疫熒光信號(hào)來(lái)源于特異性標(biāo)記熒光信號(hào)。

圖7 TrueBlack處理的珊瑚冰凍切片抗體特異性熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)Fig.7 Statistics of antibody specific fluorescence intensity in TrueBlack treated coral frozen sections 柱狀圖從左往右對(duì)應(yīng)圖6(e)、(f)、(g)、(h)的熒光強(qiáng)度,P<0.05。

圖8 Western blot驗(yàn)證抗體特異性Fig.8 The specificity of the antibody was examined by Western blotM：蛋白質(zhì)電泳的標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Marker,1：Lamp2a,2：DM1a,3：Tgn38。

2.3 討論

免疫熒光技術(shù)中自體熒光的干擾在生物界相當(dāng)普遍,如在鞭毛蟲(chóng)、腔腸動(dòng)物、多毛類、甲殼類與魚(yú)類中,而對(duì)切片自體熒光的去除無(wú)疑為樣品進(jìn)一步的組化研究提供了更好的保障。為了得出可靠有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),科學(xué)家們嘗試采用不同的方法來(lái)消除或抑制自體熒光,主要包括化學(xué)還原劑、光漂白和熒光淬滅劑。其中,化學(xué)還原劑主要針對(duì)醛與胺形成的化合物,但是化學(xué)還原劑在中性pH環(huán)境中不穩(wěn)定,使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性低[21]。光漂白方法需要將樣品長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外光下,極易發(fā)生不可逆的光氧化,不能用于已經(jīng)表達(dá)熒光的樣品,且實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng),需要特定的儀器設(shè)備[22]。常用的熒光淬滅劑包括蘇丹黑B、臺(tái)盼藍(lán)和乙醇胺等,主要通過(guò)與發(fā)光成分結(jié)合吸收入射光而降低自體熒光,但是蘇丹黑B針對(duì)不同組織時(shí),濃度及處理時(shí)間均需要摸索,較為耗時(shí)[23];臺(tái)盼藍(lán)只在488 nm激發(fā)光下才能消除自體熒光[24];乙醇胺消除自體熒光的效果較不佳[25],因此穩(wěn)定可靠的成品試劑成為消除自體熒光的新選擇。

本研究中所使用的花傘軟珊瑚,已有科學(xué)家通過(guò)將其再生和單細(xì)胞RNA測(cè)序耦合,觀察到內(nèi)共生細(xì)胞的動(dòng)態(tài)譜系進(jìn)展,這不僅有助于揭示不同珊瑚吸收或失去內(nèi)共生體的共同原理[15],也預(yù)示著在組裝拼接的高質(zhì)量基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)研究背景下,花傘軟珊瑚很可能成為研究?jī)?nèi)共生、快速生長(zhǎng)等方面的潛在模式生物。這就急需建立成熟穩(wěn)定的生物學(xué)技術(shù)以供研究使用。而TrueBlack法與酒精梯度脫水法相比,一方面保留了酒精脫水的優(yōu)點(diǎn),TrueBlack在使用前需要用70%的酒精溶解,所以TrueBlack工作液中含有酒精,有助于切片脫水徹底,另一方面又彌補(bǔ)了酒精脫水法對(duì)珊瑚自體熒光消除不顯著的不足,尤其在去除蟲(chóng)黃藻葉綠素自發(fā)熒光方面,不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟,縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng),同時(shí)還降低了樣品變形和細(xì)胞損失的可能性?？偠灾?TrueBlack以其高效、便捷、可重復(fù)強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)成為消除珊瑚自體熒光的理想選擇。

值得注意的是,在已有研究中,TrueBlack是被設(shè)計(jì)用于淬滅脂褐質(zhì)產(chǎn)生的自體熒光,脂褐質(zhì)是免疫細(xì)胞在衰老、吞噬過(guò)程中在胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生的沉積物[26],TrueBlack利用其疏水性有效結(jié)合富含脂質(zhì)的脂褐質(zhì),吸收入射光而減少自體熒光的產(chǎn)生。同時(shí)也指出這款自體熒光淬滅劑對(duì)其他組織如誘導(dǎo)的熒光或者膠原質(zhì)或彈性蛋白的內(nèi)源熒光等自體熒光的降低沒(méi)有顯著效果。珊瑚雖然脂質(zhì)含量較高[27],但是目前尚未有報(bào)道稱珊瑚中含有脂褐質(zhì),且脂褐質(zhì)主要存在于脊椎動(dòng)物中[28]。有報(bào)道稱軟珊瑚中含有多種活性物質(zhì)[29],猜測(cè)珊瑚體內(nèi)可能存在與脂褐質(zhì)類似的富含脂質(zhì)的物質(zhì),而這種物質(zhì)在免疫過(guò)程中可能扮演一定角色值得深入挖掘。TrueBlack高效去除珊瑚冰凍切片中自體熒光的能力或許可以為后續(xù)珊瑚的免疫研究提供新的思路。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)使用熒光淬滅劑TrueBlack后,花傘軟珊瑚組織切片中的自體熒光強(qiáng)度是傳統(tǒng)的酒精梯度脫水法的52.4%,在珊瑚免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中TrueBlack實(shí)驗(yàn)組的特異性熒光強(qiáng)度為對(duì)照組的205.3%,并且珊瑚內(nèi)蟲(chóng)黃藻葉綠素自發(fā)熒光也有較好的去除效果。由此推測(cè)TrueBlack與傳統(tǒng)的珊瑚自體熒光去除方法相比,效果更佳。TrueBlack具有高效、便捷、可重復(fù)強(qiáng)等優(yōu)勢(shì),或許將成為消除珊瑚自體熒光的新手段。