馬旭輝 方天富 岑明秋 俞佳

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種嚴重威脅人類生命健康的心血管疾病，發(fā)病快且死亡率高[1]。AMI 發(fā)生時，冠狀動脈急性閉塞造成心肌缺氧、營養(yǎng)物質丟失，導致心室重塑甚至心力衰竭[2]。同時，AMI 觸發(fā)的缺氧微環(huán)境會誘導廣泛的心肌細胞凋亡，進一步加重心臟損傷[3-4]。因此，減少心肌細胞凋亡可能是改善AMI 患者預后的重要策略。七葉皂苷是從七葉樹科植物天師粟的干燥成熟種子中提取得到的五環(huán)三萜皂苷，在多個癌細胞模型中表現(xiàn)出抗癌作用，包括肺腺癌、肝細胞癌和白血病[5]。此外，七葉皂苷還具有清除自由基、促進血管舒張的生物學功能[6]。過去研究表明，七葉皂苷可降低血管通透性，抑制缺氧引起的血小板內皮細胞黏附分子的積累，進而保護缺氧引起的組織損傷[7]。由此推測七葉皂苷可能對調控AMI 的進展有一定作用，但目前關于七葉皂苷和AMI 關系的研究還很少。本研究通過動物和細胞實驗探究七葉皂苷參與調控AMI 心肌損傷的機制，以期為尋找AMI 治療新藥物提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 2 月齡雄性SD 大鼠60 只，由杭州醫(yī)學院實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學院實驗動物中心SPF 級動物房，溫度（24±2）℃，濕度45%～55%，12 h 光照。實驗前大鼠適應性喂養(yǎng)1 周，自由飲食和飲水。大鼠心肌細胞H9C2 株（批號：CL-0089）購自普諾賽生命科技有限公司（武漢），使用含10% FBS和1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，正常傳代。

1.1.2 主要試劑 七葉皂苷（批號：6805-41-0）購自德國默克生物公司；miR-140-5p 模擬物由吉瑪基因合成；B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（批號：ab196495）、B 淋巴細胞瘤-2 相關X 蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）（批號：ab32503）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號：ab8245）抗體均購自艾博抗（上海）貿易有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液（批號：G3005）、細胞增殖和毒性檢測（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（批號：CA1210）、原位末端標記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（批號：T2190）均購自索萊寶科技有限公司（北京）；改良Eagle 培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）（批號：C11995500BT）、Invitrogen TRIzol（批號15596018）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；miRNA 第一鏈cDNA 合成（莖環(huán)法）試劑盒（批號：B532453-0020）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；HieffqPCR SYBRGreen Master Mix PCR 試劑盒（批號：11201ES08）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：20201ES76）均購于翊圣生物（上海）科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組和處理 60 只大鼠隨機分為4組：假手術組、AMI 組、AMI+低劑量七葉皂苷（LE）組和AMI+高劑量七葉皂苷（HE）組，每組15 只（造模死亡率較高，最終每組取6 只）。按6 mg/kg 的劑量腹腔注射舒泰麻醉，行氣管插管，連接小動物呼吸機，呼吸頻率80 次/min，吸氣/呼氣時間比1∶2。連接心電圖監(jiān)測。左側開胸，暴露心臟，在冠狀動脈起始部2～3 mm 處結扎左冠狀動脈前降支（left anterior descending，LAD）。觀察標準Ⅱ導心電圖，出現(xiàn)ST 段和（或）T 波抬高或降低，心臟局部顏色變暗等心肌缺血變化作為結扎成功的標志，關胸。假手術組只開胸，不做LAD 結扎處理。七葉皂苷用0.9%氯化鈉溶液溶解，建模前LE 組和HE 組大鼠分別給予2、10 mg/kg 七葉皂苷灌胃7 d，另兩組等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。本研究涉及的動物實驗已通過動物倫理委員會審查通過，批準文號：ZJCLA-IACUC-20020109。

1.2.2 細胞處理和分組 取H9C2 細胞，調整密度為2×105個/mL 接種至12 孔板，加入20 nmol/L 無血清培養(yǎng)基配置的miR-140-5p 模擬物，0.5 μL/孔，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，換新鮮DMEM 培養(yǎng)基。七葉皂苷用磷酸鹽緩沖液配制成10 mmol/L 母液，使用時按需（10 μmol/L）加入到培養(yǎng)基中。根據(jù)處理將細胞分為對照組、低氧組、七葉皂苷組、模擬物組。對照組正常培養(yǎng)；低氧組細胞置于含1% O2的低氧培養(yǎng)箱；七葉皂苷組加入10 μmol/L 七葉皂苷，低氧培養(yǎng)；模擬物組細胞經miR-140-5p 模擬物轉染后加入10 μmol/L 七葉皂苷，轉至低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h 后進行后續(xù)檢測。

1.3 檢測指標

1.3.1 大鼠心功能檢測 采用超聲心動圖檢測。大鼠麻醉后連接超聲診斷儀，連接Ⅱ導心電圖，在LAD 結扎后，檢測心功能指標。探頭置于胸骨左側，與胸骨中線成10°～30°，顯示胸骨左室長軸切面，探頭順時針旋轉90°顯示左室短軸切面。由二維圖像引導取M型曲線并進行測量。顯示胸骨旁左室長軸切面后，探頭略向左偏即顯示肺動脈長軸切面。在胸骨旁左室長軸切面和肺動脈長軸切面上進行二尖瓣、主動脈瓣和肺動脈各瓣口的多普勒血流檢測，利用SteeringAngle 功能，使多普勒角度盡量小，分別為18°、50°和2°。測量各組大鼠左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDd）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESd）、射血分數(shù)（ejection fraction，EF）和左室短軸縮短率（left ventricular short-axis shortening rate，F(xiàn)S）。

1.3.2 大鼠心肌梗死面積檢測 采用TTC 染色法。超聲心動圖檢測結束后通過頸椎脫臼法處死大鼠，分離心臟，4 ℃PBS 溶液洗凈，-20 ℃冷凍30 min。取心臟組織進行切片，厚度約2 mm。將切片放入TTC 染色液中37 ℃避光孵育30 min，每隔10 min 翻動1 次，使其充分染色。取出心臟切片，用PBS 洗2～3 遍后拍照。心臟非梗死區(qū)染為紅色，梗死區(qū)呈灰白色。選擇每一切片的尾側面用PhotoShop 軟件進行分析，測量每片的梗死面積和總面積。

1.3.3 大鼠心肌組織和H9C2 細胞中Bcl-2、Bax 蛋白表達水平的檢測 采用Western blot 法。使用蛋白裂解液提取心肌組織和H9C2 細胞蛋白并檢測蛋白濃度，并通過BCA 蛋白濃度測定試劑盒完成蛋白定量。使用聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白質，轉移到PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，緩沖液洗3 次，每次5～10 min，加入Bcl-2、Bax 一抗，4 ℃冰箱里孵育過夜。用TBST 洗3 次，每次10 min，加入山羊抗兔IgG 二抗，室溫下孵育2 h，用TBST 洗3 次，每次10 min。使用蛋白印跡HRP 化學發(fā)光檢測試劑盒,使蛋白條帶可視化。使用Image J 軟件進行蛋白質灰度分析，以GAPDH 為參照，計算Bcl-2、Bax 蛋白相對表達水平。

1.3.4 大鼠心肌組織和H9C2 細胞中miR-140-5p 表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。利用Invitrogen TRIzol提取心肌組織和H9C2 細胞的RNA，使用超微量分光光度計測定RNA 濃度。采用miRNA 第一鏈cDNA 合成（莖環(huán)法）試劑盒逆轉錄miRNA，使用HieffqPCR SYBRGreen Master Mix PCR 試劑盒檢測miR-140-5p 的表達水平，以U6 為內參，據(jù)2-ΔΔCt法計算mRNA 的表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.5 H9C2 細胞活性檢測 采用CCK-8 法。取各組H9C2 細胞，加入10 μL/孔CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h，酶標儀測定各組細胞在450 nm 處的吸光度值，計算細胞活性。

1.3.6 H9C2 細胞凋亡檢測 采用TUNEL 染色法。取各組H9C2 細胞，用4%多聚甲醛（室溫）固定20 min，PBS 清洗，加入Triton X-100 處理細胞20 min。PBS 洗2 遍，加入150 μL TUNEL 反應液，在37 ℃條件下處理60 min。然后用DAPI 染核5 min，PBS 洗2 遍，使用熒光顯微鏡觀察，檢測相對熒光強度。相對熒光強度越大，表明細胞凋亡程度越高。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用GraphPad prism 8.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4 組大鼠心功能比較 與假手術組相比，AMI 組大鼠LVEDd 和LVESd 顯著增大，EF 和FS 顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），表明AMI 模型構建成功。與AMI 組相比，LE 組和HE 組大鼠LVEDd 和LVESd 顯著減小，EF 和FS 顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；相比LE 組，HE 組變化更顯著，提示七葉皂苷濃度越高，心功改善效果越顯著。見表2。

表2 4 組大鼠心功能指數(shù)比較

2.2 4 組大鼠心肌組織Bax 和Bcl-2 蛋白相對表達水平的比較 與假手術組相比，AMI 組中Bax 蛋白相對表達水平上調，Bcl-2 蛋白相對表達水平下調，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示細胞凋亡加劇。相比AMI 組，LE 組和HE 組Bax 蛋白相對表達水平下調，Bcl-2 蛋白相對表達水平上調，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；相比LE 組，HE 組變化更顯著。提示七葉皂苷可抑制AMI 大鼠心肌組織凋亡，且呈濃度依賴性。見圖1。

圖1 4 組大鼠心肌組織中Bcl-2、Bax 蛋白相對表達水平的比較（A：蛋白電泳圖；B：Bcl-2 和Bax 蛋白相對表達水平）

2.3 4 組大鼠心肌梗死面積和miR-140-5p 表達水平比較 假手術組大鼠心肌無梗死區(qū)域，AMI 組心肌梗死面積較大。相比AMI 組，LE 組和HE 組心肌梗死面積減少；相比LE 組，HE 組梗死面積更小，提示具有濃度依賴性，見圖2A（插頁）。與假手術組相比，AMI 組miR-140-5p 表達水平顯著增加，與AMI 組相比，LE 組和HE 組miR-140-5p 表達水平顯著降低，與LE 組相比，HE 組miR-140-5p 表達水平進一步降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），推測七葉皂苷可能通過下調miR-140-5p 表達水平改善AMI 大鼠的心肌損傷，見圖2B（插頁）。

圖2 4 組大鼠心肌梗死面積和miR-140-5p 表達水平比較（A：心臟切片觀察；B：梗死面積；C：miR-140-5p 表達水平）

2.4 4 組H9C2 細胞活性和miR-140-5p 表達水平比較 相比對照組，低氧組細胞活性顯著降低（圖3A）；相比低氧組，七葉皂苷組細胞活性顯著上升；相比七葉皂苷組，模擬物組細胞活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3A。 相比對照組，低氧組miR-140-5p 表達水平顯著升高；相比低氧組，七葉皂苷組miR-140-5p 表達水平顯著降低；相比七葉皂苷組，模擬物組miR-140-5p 表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3B。提示七葉皂苷通過抑制miR-140-5p 表達促進細胞活性。

圖3 4 組細胞活性和miR-140-5p 表達水平比較（A：細胞活性；B：miR-140-5p 表達水平）

2.5 4 組H9C2 細胞凋亡和Bcl-2、Bax 蛋白相對表達水平比較 相比對照組，低氧組Bcl-2 蛋白相對表達水平降低，Bax 升高；相比低氧組，七葉皂苷組Bcl-2 蛋白相對表達水平升高，Bax 降低；相比七葉皂苷組，模擬物組Bcl-2 蛋白相對表達水平降低，Bax 升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4A（插頁）。相比對照組，低氧組細胞相對熒光強度顯著升高，相比低氧組，七葉皂苷組相對熒光強度顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；相比七葉皂苷組，模擬物組相對熒光強度顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4B（插頁）。提示七葉皂苷對細胞凋亡的改善作用能被miR-140-5p 模擬物逆轉。

圖4 4 組細胞凋亡水平比較（A：Bcl-2 和Bax 蛋白電泳圖和表達水平比較；B：細胞凋亡檢測和比較）

3 討論

AMI 是世界范圍內死亡的主要原因，盡管再灌注能夠成功地減少梗死面積和改善總體預后，但AMI 仍然是心力衰竭發(fā)病率和死亡率增加的主要原因[8]。研究認為，心肌細胞的突然大量丟失超過心肌的有限再生時會進一步加重缺氧誘導的心肌損傷[9]。AMI 誘導心肌細胞凋亡的機制是多方面的，包括炎癥和氧化應激。但是目前AMI 脅迫心肌細胞凋亡的機制還不完全清楚，也沒有高效的藥物干預此過程。因此，探索AMI 誘發(fā)心肌細胞凋亡機制，開發(fā)抑制心肌細胞凋亡的有效藥物對于AMI 的治療具有重要意義。本研究成功構建了AMI 動物和細胞模型，發(fā)現(xiàn)AMI 大鼠心功能下降，主要表現(xiàn)在LVEDd 和LVESd 增加，EF 和FS 降低，心臟組織出現(xiàn)大面積梗死區(qū)，促凋亡蛋白Bax 表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達下調。同時還發(fā)現(xiàn)，在低氧誘導的H9C2細胞中，細胞活性降低，凋亡水平升高。

許多研究描述了七葉皂苷在卵巢、神經系統(tǒng)、皮膚等各種組織病理生理中的作用，也研究了它在腫瘤中的作用。Selvakumar 等[10]認為，七葉皂苷在帕金森病中具有抗凋亡和抗氧化應激作用，可以改善帕金森患者的運動功能。Wang 等[11]認為，七葉皂苷對視網膜色素上皮細胞有抗氧化應激作用。Cheng 等[12]認為，七葉皂苷可調節(jié)卵巢癌細胞凋亡。最近的數(shù)據(jù)證實了七葉皂苷在降低發(fā)炎組織的血管通透性方面的抗炎特性，從而抑制水腫形成[13]。在體內，七葉皂苷可通過減輕體質量、改善糖脂代謝、部分拮抗低度炎癥和改善胰島素抵抗來預防或治療肥胖[14]，減輕糖尿病大鼠心臟自主神經病變[15]。此外，七葉皂苷通過NF-κB 信號通路抑制H2O2誘導的H9C2 細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在AMI 動物和細胞模型中，心肌細胞損傷都十分顯著，七葉皂苷處理后，心肌損傷有所改善，且七葉皂苷濃度越高，改善效果越明顯。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼RNA，是轉錄后主要的調控因子，幾乎參與所有細胞過程。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 是心臟病生理和病理過程中的關鍵調節(jié)因子[17]。如miR-27a-5p 可通過抑制Atg7 減輕缺氧誘導的大鼠心肌細胞損傷[18]，miR-21 通過蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mamamalian target of rapamycin，mTOR）通路減少細胞凋亡，緩解缺氧/復氧誘導的H9C2 細胞損傷[19]。此外，miR-223 通過Akt/mTOR 通路靶向DNA 修復酶（poly-ribose polymerase，PARP）-1，緩解缺氧誘導的大鼠心肌細胞過度自噬和凋亡[20]。miR-133a 是心臟中最豐富的miRNA之一，多項研究表明，miR-133a 參與了心肌梗死的早期病理以及隨后的心臟重塑[21]。miR-208 通過靶向抑制程序性細胞死亡因子（programmed cell death，PDCD）4 抑制急性心肌梗死小鼠心肌組織凋亡[22]。miR-122-5p 的循環(huán)細胞外囊泡穿梭以Bcl-2 依賴性方式調節(jié)心肌細胞的活力和凋亡[23]。這些研究提示miRNA 可能成為缺血性心臟病治療的潛在靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p 在AMI 動物和細胞模型中都呈現(xiàn)高表達，但經過七葉皂苷治療后，不僅心肌損傷有所改善，還能降低miR-140-5p 的表達水平，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。近年研究表明，miR-140-5p 的異常表達與心臟疾病相關。miR-140-5p 不僅參與調控糖尿病心肌病心肌細胞凋亡[24]，還能靶向Bcl-2 L1 促進心肌細胞凋亡[25]。本研究轉染miR-140-5p 模擬物，結果發(fā)現(xiàn)七葉皂苷對低氧誘導H9C2 細胞損傷的改善作用被逆轉，表明七葉皂苷可能通過抑制miR-140-5p 表達，改善AMI 心肌損傷。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷通過調控miR-140-5p參與AMI 心肌損傷。本研究結果為探索AMI 誘發(fā)心肌細胞凋亡機制，開發(fā)有效抑制心肌細胞凋亡靶向藥物提供理論依據(jù)，對AMI 防治具有重要意義。