於櫻枝 楊朝暉 朱楚夢 曹學全 蔡小波 顧華敏 盧洪勝

中國癌癥報告顯示，2020 年中國肺癌發(fā)病率占所有癌癥的17.9%，致死率占23.8%，發(fā)病率與致死率均是眾癌之首[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌發(fā)病的80%～85%，容易發(fā)生轉移且預后較差[2]。目前，NSCLC 發(fā)病機制尚不清楚，有報道認為是由表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變驅動的[3-5]。研究提示，血清腫瘤標志物中鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）和糖類抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）與NSCLC 患者發(fā)生EGFR 突變存在著較強的關聯(lián)性，與吸煙史、年齡、其他腫瘤標志物等臨床相關指標的聯(lián)合評估可有效提高EGFR 突變的鑒別診斷能力，值得進一步深入研究[6-8]。對疾病分子發(fā)病機制與臨床病理結果相關性的深入研究可促進疾病個性化治療的發(fā)展。因此，針對NSCLC 的基因突變與臨床相關指標的相關性研究非常有必要。二代測序（nextgeneration sequencing，NGS）技術的不斷發(fā)展逐漸完善了NSCLC 的基因表達譜，促使NSCLC 基因組分型成為疾病精準治療的重要環(huán)節(jié)。本研究利用NGS 技術檢測NSCLC 樣本中常見驅動基因的突變情況，分析驅動基因突變特點與常規(guī)血清腫瘤標志物及患者臨床病理特征的關系，以期為NSCLC的個性化治療提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇臺州市中心醫(yī)院2018 年1 月至2022年11 月收治的120 例初診且未經(jīng)過治療的NSCLC 患者，均經(jīng)影像學和病理學檢查確診，年齡39～92 歲，其中男65 例，女55 例。收集患者年齡、性別、病史、病理診斷、外周血和影像學檢查結果等臨床資料，并獨立錄入安全數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 血清腫瘤標志物檢測 提取血樣并立即分離血清，保存于-80℃冰箱備用。癌胚抗原（carcinoma embryonic antigen，CEA）、SCC、CA125、細胞角蛋白21 片段抗原（cytokeratin fragment 21-1 antigen，CYFRA21-1）采用雅培化學發(fā)光分析儀及其配套試劑檢測，胃泌素釋放前體（pro-gastrin releasing peptide，Pro-GRP）采用羅氏E411免疫發(fā)光分析儀及其配套試劑檢測。各腫瘤標志物的檢測截斷值：CEA 為6.5 μg/L，CA125 為35.0 U/mL、SCC 為2.0 μg/L、Pro-GRP 為63.0 ng/L、CYFRA21-1為3.3 μg/L。所有實驗均在室溫下重復進行，并進行避光試驗。

1.2.2 基因檢測 所有患者的肺癌組織均經(jīng)常規(guī)病理檢查證實，并進行基因檢測。所有樣本采用QIAamp DNA FFPE 組織試劑盒（美國凱杰公司）按說明書提取DNA，通過Qubit dsDNA 檢測技術（美國賽默飛世爾公司）進行DNA 濃度測定。腫瘤細胞含量≥10%，DNA 樣本總量≥30 ng。采用人多基因突變聯(lián)合檢測試劑盒（廣州燃石醫(yī)學檢驗所有限公司），定性分析NSCLC患者EGFR、鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（vrafmurine sarcoma viral oncegene homolog B1，BRAF）、c-ros 肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene1，ROS1）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、間質上皮轉化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha，PIK3CA）等9 種驅動基因的多種變異狀態(tài)，包括點突變、插入缺失、融合（重排）和擴增。通過ABI7500 實時PCR 系統(tǒng)進行擴增建庫?；驒z測平臺為Illumina（NextSeq 550AR）。經(jīng)NGS 技術進行多種驅動基因檢測，操作方法和數(shù)據(jù)分析均遵循檢測平臺指南要求。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗分析不同臨床病理特征及腫瘤標志物水平患者驅動基因突變情況的差異。采用Spearman 秩相關分析驅動基因突變情況與臨床病理特征及腫瘤標志物水平的相關性，r＜0.5 為低度相關，0.5≤r＜0.8 為中度相關，r＞0.8 為高度相關。使用AUC 評估臨床病理特征及腫瘤標志物對突變類型的診斷效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 患者各驅動基因的突變情況 納入的120例NSCLC 患者中，EGFR 基因突變83 例，KARS 基因突變13 例，TP53 基因突變15 例，PIK3CA 基因突變8 例，HER-2 基因突變6 例，BARF 基因突變5 例，ROS1 和MET 基因突變各4 例，ALK 基因突變3 例。單一位點突變89 例，多位點突變31 例。9 種驅動基因的單一位點突變分別為EGFR 59 例（49.17%），KRAS 9 例（7.50%），BRAF 5 例（4.17%），ROS1 和HER-2 各4 例（各3.33%），ALK 3 例（2.50%），MET 和TP53 各2 例（各1.67%），PIK3CA 1 例（0.83%）。EGFR、KRAS、BRAF 突變、ROS1 融合的發(fā)生率相對較高。檢出的83例EGFR基因突變中，單一位點突變59例，主要突變類型為EGFR 19-del 和EGFR L858R，分別為31 例（52.54%）和24例（40.68%）；其次是EGFR ex20-ins、EGFR G719 和EGFR L861Q，分別為2 例（3.39%）、1 例（1.69%）和1 例（1.69%）。EGFR 基因多位點突變24 例，其中合并TP53 基因突變和PIK3CA 基因突變各1 例。

2.2 不同臨床病理特征及腫瘤標志物水平患者驅動基因突變情況的差異 臨床分期Ⅲ+Ⅳ期患者TP53 突變發(fā)生率高于Ⅰ+Ⅱ期患者，發(fā)生淋巴結轉移患者EGFR 突變發(fā)生率高于未轉移患者，CEA＜6.5 μg/L 患者ROS1 突變發(fā)生率高于CEA≥6.5 μg/L 患者，SCC≥2.0 μg/L 患者PIK3CA 突變發(fā)生率高于SCC＜2.0 μg/L患者，Pro-GRP≥63.0 ng/L 患者HER-2 突變發(fā)生率高于Pro-GRP＜63.0 ng/L 患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。KRAS、ALK、BRAF 和MET 等基因的突變在不同臨床病理特征及腫瘤標志物水平的患者中比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表1。

2.3 單一位點突變組與多位點突變組患者臨床病理特征及腫瘤標志物水平的比較 根據(jù)基因檢測結果顯示的突變類型將120 例NSCLC 患者分為單一位點突變組（89 例）和多位點突變組（31 例）。兩組淋巴結轉移情況、臨床分期、血清CEA 和CA125 水平比較，差異均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05）。發(fā)生淋巴結轉移的患者相較于未發(fā)生淋巴結轉移的患者具有更高的多基因共突變的頻率（P＜0.05），肺癌晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）的患者相較于早期（Ⅰ期+Ⅱ期）的患者更易發(fā)生多基因共突變（P＜0.01），高血清CEA 水平（≥6.5 μg/L）的病例多基因共突變頻率高于低血清CEA 水平（＜6.5 μg/L）的病例（P＜0.05），高血清CA125 水平（≥35.0 U/mL）的病例多基因共突變頻率高于低血清CA125 水平（＜35.0 U/mL）的病例（P＜0.05），見表2。

表2 單一位點突變組與多位點突變組患者臨床病理特征及腫瘤標志物水平的比較[例（%）]

2.4 驅動基因突變與臨床病理特征及腫瘤標志物水平的相關性分析 Spearman 相關性分析顯示，NSCLC患者發(fā)生突變的類型與淋巴結轉移和血清CEA、CYFRA21-1 水平中度相關，與CA125 和臨床分期高度相關，見表3。

表3 驅動基因突變與臨床病理特征及腫瘤標志物水平的相關性分析

2.5 臨床病理特征及腫瘤標志物水平對驅動基因突變類型診斷效能評估 患者年齡、性別、吸煙史、淋巴結轉移情況、臨床分期、CEA、CA125、SCC、Pro-GRP、CYFRA21-1 在診斷突變類型時的AUC 均＞0.5，其中淋巴結轉移（AUC=0.602，P＜0.01）、臨床分期（AUC=0.621，P＜0.01）、血清CEA（AUC=0.618，P＜0.05）具有較好的診斷效能，見表4。

表4 臨床病理特征及腫瘤標志物水平在突變類型診斷中的效能評估

3 討論

肺癌是全球癌癥致死率最高的癌種，占癌癥死亡總數(shù)的18%[9]。隨著生活習慣的變化，NSCLC 的發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化，約30%的晚期患者發(fā)生轉移[10]。已有研究表明，NSCLC 患者在未得到有效治療的情況下中位生存時間僅為1 個月[10]。隨著小分子抑制劑和免疫檢查點抑制劑的引入，NSCLC 患者尤其是晚期患者個性化治療的需求越來越大，傳統(tǒng)的治療方式已經(jīng)不足以緩解現(xiàn)在臨床的治療負擔[11-14]。近年來，特異性分子靶向藥物的興起加速了個性化治療的發(fā)展，顯著提高了患者的總生存率，有效改善患者預后。隨著抗體-藥物偶聯(lián)物、細胞因子治療、嵌合抗原受體-T 細胞治療等新型治療方式的出現(xiàn)，NSCLC 患者的治療前景得到了很大的拓展[15-16]。隨著基因測序技術在臨床及臨床研究中的廣泛應用，基于NSCLC 的分子層面的研究逐漸深入，引導患者的個性化治療的方案逐步完善，迎來了靶向驅動基因指導下的分子治療的新高潮[17-19]。EGFR、ALK、KRAS、ROS1、RET 等驅動基因的檢測在指導患者用藥中發(fā)揮了重要的作用[20]。目前，EGFR 家族引導的靶向治療是最具有驗證性和廣泛應用的前景。酪氨酸激酶活化是腫瘤生長與發(fā)生變化的重要條件，因此對這條活化通路的精準打擊與抑制成為抑制腫瘤生長實現(xiàn)抗腫瘤作用的重要策略。EGFR 酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼對攜帶有EGFR 基因突變的NSCLC 患者有較好的治療效果，這更加激發(fā)了臨床對NSCLC 靶向治療的信心[21]。NGS 在少量樣本的條件下仍然可獲得多基因多位點的突變信息，并利用這些突變信息為患者選擇合適的靶向治療，也在一定程度上引導了新的靶向藥物的研究[22]。

本研究納入了120 例NSCLC 病例，具有單一突變位點的病例中經(jīng)典突變EGFR 19-del 和EGFR L858R突變占93.22%，其他突變包括EGFR ex20-ins、EGFR G719 和EGFR L861Q 等。除EGFR 以外，其他基因的突變頻率均未發(fā)現(xiàn)與患者的年齡、性別、吸煙史、臨床分期及血清腫瘤標志物等存在相關性。進一步聚焦研究EGFR 基因突變與相關臨床指標的相關性發(fā)現(xiàn)，具有淋巴結轉移的晚期NSCLC 患者，發(fā)生EGFR 突變的概率更高。提示探討基因突變與臨床病理特征的關系對評估患者基因突變狀態(tài)有利。

血清腫瘤標志物是一類循環(huán)蛋白質分子，由腫瘤細胞或身體的其他細胞產(chǎn)生，以鑒別癌癥或某些良性疾病[16]。腫瘤標志物表達水平的改變具有一定的預測預后和在隨訪期間評估治療反應的價值。有研究發(fā)現(xiàn)血清CA125、CEA、CYFRA21-1、SCC 和pro-GRP 水平與NSCLC 疾病進程相關[23]。Shoji 等[24]研究認為EGFR 基因突變頻率與患者血清CEA 水平呈正相關，即血清CEA 可以預測EGFR 突變。本研究結果顯示，高血清CEA 水平（≥6.5 μg/L）的NSCLC 患者發(fā)生多位點共存突變的頻率（71%）顯著高于低血清CEA 水平（＜6.5 μg/L）患者（P＜0.05）；就相關性分析結果來看，高血清CEA 水平與發(fā)生多位點共存突變具有相關性（P＜0.05），這提示血清CEA 水平可能與NSCLC 患者驅動基因多位點突變存在正相關。同時，高血清CA125 水平（≥35.0 U/mL）患者發(fā)生多位點共存突變的頻率明顯高于低血清CA125 水平低患者（P＜0.05），即高血清CA125 水平與發(fā)生多位點共存突變具有相關性（P＜0.05），提示CA125 濃度升高與多位點突變率存在正相關。而CYFRA21-1、SCC 和Pro-GRP 的表達差異未檢測出與NSCLC 患者驅動基因多位點突變率存在相關性。在具有單一突變位點的病例中，CYFRA21-1、SCC和Pro-GRP 的表達也不具有統(tǒng)計學差異。與此同時，淋巴結轉移（P＜0.05）和臨床分期（P＜0.01）作為可以提示疾病進展的兩項臨床指標也被檢測出與多位點共存突變的發(fā)生具有顯著相關性。這些結果提示分析患者的基因突變情況與其臨床病理特征的和腫瘤標志物水平關系對患者基因突變類型診斷有不可忽略的重要性。

本研究利用淋巴結轉移、臨床分期、CA125 與血清CEA 水平對多位點突變的患者進行篩選，遺憾的是單項標志物進行診斷的性能并不理想。AUC 值最高的為臨床分期，僅有0.621，靈敏度雖高達0.969，但特異度僅為0.273，其診斷性能遠遠不足以對患者的基因突變類型進行有效區(qū)分。尋找新的更具有特異性的多項標志物，對患者血清水平進行多標志物聯(lián)合檢測的診斷性能或許能夠有效地提升對多突變位點的患者的篩查性能。有研究回顧性分析了210 例NSCLC 患者的基因表達及臨床特征信息，結合幾項多指標預測基因突變AUC 值可達0.80，這也提示了多指標聯(lián)合檢測的有效性[25]。本研究還對現(xiàn)有臨床指標及腫瘤標志物進行了建模分析，并未找到具備預測價值的模型，可能與標志物特異性不強有關，另外樣本層次的豐富度可能也是一大影響因素。后續(xù)研究通過擴大樣本量，納入更多具備特異性的腫瘤標志物可能會優(yōu)化模型，提升模型的特異度和靈敏度，因此需要開展多中心大樣本的研究。

綜上所述，NSCLC 患者EGFR 基因突變可與其他驅動基因突變共存，且多位點突變共存的發(fā)生頻率與淋巴結轉移、臨床分期、血清CEA 和CA125 水平有顯著相關性。通過NGS 發(fā)現(xiàn)的多位點共存型突變及少見突變應引起重視，可提示臨床及時調整治療方案，為NSCLC 的精準治療提供輔助策略。分析驅動基因突變特點與常規(guī)血清腫瘤標志物及患者臨床病理特征的關系，可為NSCLC 的個性化治療提供參考。