楊冰雪,易 淼,袁亞玲,黃金珠,夏培雯,黨梓軍,廖佳佳,羅勝利,夏 云△

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 400042; 2.成都市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,四川成都 610000

耐碳青霉烯的腸桿菌目細(xì)菌(CRE)是近年來(lái)備受關(guān)注的條件致病菌,其與院內(nèi)感染性疾病的發(fā)病率和病死率密切相關(guān)[1]。CRE的出現(xiàn)導(dǎo)致多耐藥細(xì)菌感染治療最后手段——碳青霉烯類(lèi)藥物失活,對(duì)全球感染控制和疾病治療形成了極大挑戰(zhàn)[2],CRE的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測(cè)對(duì)臨床感染性疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE最主要的耐藥機(jī)制,根據(jù)Ambler分類(lèi)法可將碳青霉烯酶分為 A、B、D 類(lèi)酶[3];其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)是A類(lèi)酶的典型代表,作為KPC的主要生產(chǎn)者,肺炎克雷伯菌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌目細(xì)菌(CPE)[4-5]。2020年我國(guó)國(guó)家耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET,www.chinets.com)數(shù)據(jù)顯示,2005-2018年肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南(IPM)和美羅培南(MEM)的耐藥率分別從3.0%上升至25.0%和2.9%上升至26.3%[6]。B類(lèi)酶又稱金屬β-內(nèi)酰胺酶,常見(jiàn)的金屬β-內(nèi)酰胺酶包括維羅納整合子編碼金屬β-內(nèi)酰胺酶(VIM)、亞胺培南金屬β-內(nèi)酰胺酶(IMP) 和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM)[7];自2008年首次在印度發(fā)現(xiàn)NDM以來(lái)[8],其在腸桿菌科、不動(dòng)桿菌屬及假單胞菌屬細(xì)菌中多有出現(xiàn)[9],我國(guó)2017年一項(xiàng)在腸桿菌科細(xì)菌和不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中進(jìn)行的多中心研究表明含有NDM型基因的致病菌在國(guó)內(nèi)廣泛傳播[10]。文獻(xiàn)[11]調(diào)查顯示,2018-2019年在四川地區(qū),NDM在CRE中的檢出率達(dá)到42.1%。在D類(lèi)酶中,OXA-48-like則是全球某些地區(qū)腸桿菌目細(xì)菌中最常見(jiàn)的碳青霉烯類(lèi)型,并且正在逐步進(jìn)入非流行地區(qū),造成院內(nèi)感染暴發(fā)[12]。編碼碳青霉烯酶的耐藥基因多位于可移動(dòng)元件上,比如轉(zhuǎn)座子、整合子和質(zhì)粒[13]。耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移和傳播可導(dǎo)致CRE在全球范圍內(nèi)蔓延[14]。目前用于檢測(cè)CRE的方法主要有表型檢測(cè)和分子檢測(cè)。常見(jiàn)的表型檢測(cè)方法包括Triton Hodge 試驗(yàn)、改良 Hodge 試驗(yàn)、Carba NP 試驗(yàn)、碳青霉烯滅活法[包括改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM)和乙二胺四乙酸(EDTA)改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(eCIM)]及碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)等[15-16]。大多數(shù)檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單,經(jīng)濟(jì)成本低,但最顯著的問(wèn)題是耗時(shí)較長(zhǎng)。分子檢測(cè)法通常被認(rèn)為是碳青霉烯酶檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[3],普通PCR是最常用的分子檢測(cè)方法,但使用PCR逐一檢測(cè)耐藥基因的時(shí)間成本高,本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確的多重PCR體系,能同時(shí)檢測(cè)包括KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48-like在內(nèi)的5種碳青霉烯酶耐藥基因,并將其運(yùn)用于臨床分離的CRE菌株檢測(cè),與普通PCR及碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果相比較,從靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、一致性等方面進(jìn)行分析,評(píng)價(jià)該方法的可行性,從而為臨床提供早期診斷、治療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科2020年6月至2021年9月臨床鑒定為對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥的(亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度≥4 μg/mL)非重復(fù)腸桿菌目細(xì)菌共118株和對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物敏感的腸桿菌目細(xì)菌9株。其中CRE包括肺炎克雷伯菌68株,大腸埃希菌29株,陰溝腸桿菌16株,布氏檸檬酸桿菌1株,產(chǎn)氣克雷伯菌2株,產(chǎn)酸克雷伯菌1株,弗氏檸檬酸桿菌1株;敏感菌株包括7株肺炎克雷伯菌,2株大腸埃希菌。主要標(biāo)本來(lái)源包括血液、尿液、傷口分泌物、穿刺液、呼吸道標(biāo)本及膽汁、肛門(mén)拭子等。攜帶blaKPC、blaIMP、blaOXA-48-like的肺炎克雷伯菌,攜帶blaVIM 的銅綠假單胞菌和攜帶blaNDM的大腸埃希菌作為陽(yáng)性對(duì)照,均由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2儀器與試劑 VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套板卡(法國(guó)生物梅里埃公司);PCR擴(kuò)增儀(ABI公司);電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司);哥倫比亞血瓊脂平板及MH平板(重慶龐通公司);美羅培南藥敏紙片(Oxoid公司);DNA分子量標(biāo)記物DL2000、Taq酶(TaKaRa公司);瓊脂糖(Hydragene公司);本試驗(yàn)所用引物合成及擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均來(lái)自北京擎科生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 收集非重復(fù)臨床標(biāo)本分離株,使用Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn),將收集的碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥菌株及敏感菌株-80 ℃冷凍保存。

1.3.2碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn) 根據(jù)A類(lèi)絲氨酸碳青霉烯酶的活性可被3-氨基苯硼酸(APB)抑制,金屬β-內(nèi)酰胺酶的活性可被EDTA抑制原理,使用碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行碳青霉烯酶表型鑒定,具體操作步驟如下:將待測(cè)菌調(diào)節(jié)成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?均勻涂布于MH培養(yǎng)基上,隨后貼4張美羅培南紙片(10 μg),在其中兩張紙片上分別滴加APB、EDTA溶液,另一張紙片上同時(shí)滴加兩種溶液,最后一張紙片不滴加任何溶液留作空白對(duì)照?？諝猸h(huán)境,(35±2)℃培養(yǎng)16～18 h后分別測(cè)量4個(gè)抑菌圈直徑(dr)。判讀標(biāo)準(zhǔn):若dr美羅培南+APB-dr美羅培南≥5 mm,則可認(rèn)為受試菌株產(chǎn)A類(lèi)酶,若dr美羅培南+EDTA-dr美羅培南≥ 5 mm,則可認(rèn)為受試菌株產(chǎn)B類(lèi)酶,若dr美羅培南+EDTA+APB-dr美羅培南≥ 5 mm,則可認(rèn)為受試菌株同時(shí)產(chǎn)A類(lèi)酶和B類(lèi)酶。

1.3.3DNA提取 本試驗(yàn)采用煮沸裂解法提取細(xì)菌DNA。將-80 ℃儲(chǔ)存的分離菌復(fù)蘇后接種在哥倫比亞血平板上培養(yǎng)16～18 h,取單個(gè)菌落懸浮于1 000 μL蒸餾水中,95 ℃煮沸10 min,在4 ℃,13 000 r/min離心混合物10 min,分離上清液作為DNA樣本保留,并儲(chǔ)存于-20 ℃。

1.3.4引物設(shè)計(jì) 下載Bate-Lactamase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bldb.eu/BLDB.php?prot=A#GES)已公布的blaKPC基因序列[17],使用軟件ClustalXe 2.0進(jìn)行序列比對(duì),選擇高度同源區(qū)域,使用primer premier 5 進(jìn)行blaKPC引物設(shè)計(jì)。根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)下載blaNDM,blaIMP,blaVIM,blaOXA-48-like引物[18-19,1]。引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。見(jiàn)表1。

表1 5種碳青霉烯酶耐藥基因擴(kuò)增引物

1.3.5普通PCR 普通PCR反應(yīng)體系:premix taq 12.5 μL,正反向引物各(10 μm)1.0 μL,DNA 模板1.5 μL,加雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)足至25.0 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,57 ℃ (blaKPC、blaNDM、blaVIM)/55 ℃ (blaIMP、blaOXA-48-like) 30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán),72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析,產(chǎn)物送基因測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast 比對(duì)(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/),確定基因型。

1.3.6多重PCR 多重PCR反應(yīng)條件采用25.0 μL體系:premix taq 12.5 μL,5種不同引物構(gòu)成比例見(jiàn)表1,DNA模板1.5 μL,加ddH2O補(bǔ)足25.0 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 40 s,57 ℃ 40 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,配對(duì)卡方檢驗(yàn)用于試驗(yàn)結(jié)果分析,采用靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)多重PCR、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)與普通PCR的有效性。Cohen′s kappa (κ)系數(shù)評(píng)估多重PCR、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)與普通PCR 的檢測(cè)一致性。κ系數(shù)的比較含義:κ>0.75,一致性極好;κ為0.40～0.75,檢測(cè)方法之間存在一致性;κ<0.40,檢測(cè)方法之間一致性較差,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1多重PCR檢測(cè)5種碳青霉烯酶耐藥基因 建立多重 PCR 體系,分別擴(kuò)增含有blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48-like基因的DNA陽(yáng)性對(duì)照模板;另將5種陽(yáng)性對(duì)照DNA模板按等比例混合后進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增;考慮到多重PCR反應(yīng)過(guò)程中存在引物二聚體及非特異擴(kuò)增風(fēng)險(xiǎn)增加的問(wèn)題,另對(duì)8株碳青霉烯類(lèi)藥物敏感的腸桿菌目細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增,用于評(píng)估多重PCR的正確性。擴(kuò)增結(jié)果使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。在最佳反應(yīng)條件下,多重PCR能分別正確擴(kuò)增出5種不同的耐藥基因,也能在單次反應(yīng)中同時(shí)識(shí)別出多種耐藥基因(圖1A),整體擴(kuò)增體系較為穩(wěn)定,對(duì)敏感菌的擴(kuò)增產(chǎn)物中幾乎不含有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1B)。

注:A表示使用多重PCR擴(kuò)增含有5種碳青霉烯酶耐藥基因的陽(yáng)性DNA模板,泳道m(xù)為2 000 bp DNA分子量標(biāo)記物;泳道A～E依次為NDM、KPC、OXA、VIM、IMP;泳道H為單次多重PCR擴(kuò)增同時(shí)含有5種耐藥基因的模板混合物;B表示多重PCR體系擴(kuò)增對(duì)碳青霉類(lèi)藥物敏感的腸桿菌目細(xì)菌DNA;泳道m(xù)～E與A的注解相同,泳道F～N為多重PCR擴(kuò)增8株對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物敏感菌DNA結(jié)果。

2.2普通PCR與多重PCR檢測(cè)結(jié)果比較 藥敏試驗(yàn)確定127株細(xì)菌中包含9株對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物敏感菌及118株對(duì)碳青霉類(lèi)藥物耐藥菌。普通PCR檢測(cè)含有碳青霉烯酶耐藥基因CRE菌株96株(81.36%,96/118),耐藥但不含碳青霉烯酶耐藥基因菌株22株(18.64%,22/118),碳青霉烯酶耐藥基因以blaKPC和blaNDM為主,分別占39.83%(47/118)和38.14%(45/118);含有blaKPC的菌株全部為肺炎克雷伯菌,而含有blaNDM的菌株包括肺炎克雷伯菌9株,大腸埃希菌22株,陰溝腸桿菌12株,弗氏檸檬酸桿菌1株,產(chǎn)酸克雷伯菌1株;共表達(dá)blaKPC+blaNDM 3株,包括產(chǎn)氣克雷伯菌,布氏檸檬酸桿菌及肺炎克雷伯菌。多重PCR檢測(cè)118株CRE中包含碳青霉烯酶耐藥基因菌株85株(72.03%;85/118);耐藥但不含碳青霉烯酶耐藥基因菌株33株(27.97%;33/118),其中22株與普通PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致,另外11株為普通PCR檢測(cè)含有碳青霉烯酶耐藥基因但多重PCR檢測(cè)為不含碳青霉烯酶耐藥基因的CRE。在檢測(cè)結(jié)果不一致的11株CRE菌株中,包括表達(dá)blaKPC的4株肺炎克雷伯菌和表達(dá)blaNDM的1株肺炎克雷伯菌、 3株大腸埃希菌、2 株陰溝腸桿菌及 1株產(chǎn)酸克雷伯菌;9株敏感菌的多重PCR檢測(cè)結(jié)果與普通PCR檢測(cè)結(jié)果一致。共表達(dá)blaKPC+blaNDM的3株CRE的多重PCR檢測(cè)結(jié)果與普通PCR檢測(cè)結(jié)果一致。見(jiàn)表2。

表2 普通PCR和多重PCR檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌結(jié)果對(duì)比(n)

2.3多重PCR與碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)的耐藥表型檢測(cè)結(jié)果比較 碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)?zāi)退幈硇蜋z測(cè)共含有94株產(chǎn)A類(lèi)酶或B類(lèi)酶的CRE和24株不產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE。在產(chǎn)A類(lèi)酶46株耐藥菌中,多重PCR檢測(cè)含有blaKPC基因CRE 43株;產(chǎn)B類(lèi)酶的48株耐藥菌中,多重PCR檢測(cè)含有blaNDM基因CRE 38株;碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)表型檢測(cè)中未檢測(cè)到同時(shí)產(chǎn)A+B類(lèi)酶的菌株,但多重PCR檢測(cè)到3株共表達(dá)blaKPC+blaNDM基因耐藥菌株;多重PCR檢測(cè)含有blaOXA-48-like的菌株碳青霉抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)表型檢測(cè)為不產(chǎn)酶CRE。見(jiàn)表3。

表3 多重PCR和碳青霉酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)127株腸桿菌目細(xì)菌基因型及耐藥表型(n)

2.4多重PCR、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果分析 以普通PCR檢測(cè)方法作為參考,多重PCR檢測(cè)靈敏度為88.54%,特異度為100.00%,κ值為0.79。碳青霉抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)靈敏度為92.71%,特異度為93.55%,κ值為0.81。在CRE檢測(cè)中,多重PCR檢測(cè)的靈敏度稍低于碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)(88.54%vs.92.71%),但多重PCR比抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)擁有更好的特異度(100.00%vs.93.55%),見(jiàn)表4。多重PCR和碳青霉烯抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)在陽(yáng)性率檢測(cè)上比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),并且二者擁有良好的檢測(cè)一致性(κ=0.63)。見(jiàn)表5。

表4 多重PCR和碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)和普通PCR檢測(cè)結(jié)果分析

3 討 論

CRE的出現(xiàn),尤其是對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌,給發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家的公共醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)造成極大威脅和負(fù)擔(dān)[20-21]。CRE的傳播具有極高的隱匿性,相對(duì)于無(wú)癥狀感染者或定植人群,CRE的實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性病例報(bào)告數(shù)比例約為1∶100[22],而其他兩類(lèi)人群可以向陽(yáng)性病例轉(zhuǎn)化[23]。因此建立一種快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室方法用于檢測(cè)CRE,為臨床早期提供診斷治療依據(jù)具有重要意義。目前,一線臨床實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)CRE及其耐藥表型最常用的方法包括抗菌藥物藥敏試驗(yàn)和紙片擴(kuò)散法等,雖然操作簡(jiǎn)便但其耗時(shí)較長(zhǎng),臨床報(bào)告時(shí)間在16～24 h,且無(wú)法明確具體的碳青霉烯酶類(lèi)型。本研究建立多重 PCR 檢測(cè)法,可在單次試驗(yàn)中快速篩查5種常見(jiàn)的碳青霉烯酶耐藥基因,并可基于耐藥基因檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)耐藥表型,與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比,多重PCR可在3～4 h獲得檢測(cè)結(jié)果,大幅縮短臨床報(bào)告時(shí)間,為早期臨床診療提供可靠依據(jù)。

在本研究中發(fā)現(xiàn)22株(17.3%,22/127)不產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE,其耐藥機(jī)制可能是染色體突變(如孔蛋白基因突變、外排泵過(guò)表達(dá)和(或)青霉素結(jié)合蛋白改變)和獲得性非碳青霉烯耐藥機(jī)制(如超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)獲取或上調(diào)、產(chǎn)AmpC酶)[24]。多重 PCR 對(duì)這類(lèi)耐藥細(xì)菌的檢測(cè)能力有限,但文獻(xiàn)[25]研究證實(shí),CPE病死率(32.4%)高于不產(chǎn)碳青霉烯酶CRE (13.0%),故對(duì)CPE的檢測(cè)更為重要。3株由多重PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共表達(dá)blaKPC+blaNDM的菌株在碳青霉烯抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)表型檢測(cè)中僅表達(dá)一類(lèi)酶,這可能是因?yàn)樵谌狈咕幬飰毫Φ膫鞔囵B(yǎng)下,含有耐藥基因的質(zhì)粒缺乏穩(wěn)定性而丟失[26],導(dǎo)致表型檢測(cè)假陰性。7株碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)表型檢測(cè)為產(chǎn)B類(lèi)酶的CRE在多重PCR檢測(cè)中并未檢出相應(yīng)耐藥基因,可能是因?yàn)槎嘀豍CR體系引物種類(lèi)較多,在擴(kuò)增過(guò)程干擾風(fēng)險(xiǎn)增加,因此更難獲得較長(zhǎng)片段產(chǎn)物。

此外,1株多重PCR檢測(cè)含有blaOXA-48-like耐藥基因的肺炎克雷伯菌在碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)表型檢測(cè)中為假陰性,由于表型檢測(cè)中試劑APB、EDTA僅能抑制A類(lèi)酶和B類(lèi)酶而對(duì)D類(lèi)酶沒(méi)有影響,故不能檢測(cè)OXA-48型碳青霉烯酶[27],說(shuō)明相較于表型檢測(cè),多重PCR在CRE的監(jiān)測(cè)中更具全面性。blaOXA-48-like經(jīng)測(cè)序后序列對(duì)比鑒定為blaOXA-181。blaOXA-181被認(rèn)為是除blaOXA-48外最常見(jiàn)的blaOXA-48-like基因,常出現(xiàn)在大腸埃希菌中,目前發(fā)現(xiàn)的blaOXA-181幾乎都位于含有Tn2013的lncX3質(zhì)粒上[28]。我國(guó)最早關(guān)于blaOXA-181的報(bào)道是文獻(xiàn)[29]發(fā)現(xiàn)的1株大腸埃希菌,本研究中發(fā)現(xiàn)含有blaOXA-181的是肺炎克雷伯菌,耐藥基因在腸桿菌目細(xì)菌之間的傳播及基因分子特性值得進(jìn)一步探究。

近年來(lái),基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、免疫層析法及基于生物發(fā)光技術(shù)的碳青霉烯酶藥敏試驗(yàn)檢測(cè)等多種新技術(shù)被應(yīng)用于碳青霉烯酶的檢測(cè)[30-32]。這些技術(shù)擁有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn),但技術(shù)設(shè)備、耗材及人力成本昂貴,難以在大量基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中展開(kāi)。目前也有其他多重PCR 技術(shù)的報(bào)道,例如,YOSHIOKA等[33]使用COBAS?z480同時(shí)檢測(cè)6種碳青霉烯酶耐藥基因,雖然其時(shí)間成本低于多重 PCR,但由于設(shè)備的限制需將6種基因分次構(gòu)建為同時(shí)檢測(cè)3組耐藥基因的分組,增加了操作過(guò)程的復(fù)雜性,另外檢測(cè)過(guò)程中熒光探針的使用也增加了經(jīng)濟(jì)成本。相比之下,多重PCR使用普通PCR設(shè)備即可完成,且操作步驟簡(jiǎn)單,能快速、方便、準(zhǔn)確檢測(cè)腸桿菌目細(xì)菌中5種常見(jiàn)碳青霉烯酶耐藥基因,與目前臨床應(yīng)用的碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)在CRE及其表型檢測(cè)結(jié)果上具有良好的一致性,極大縮短臨床報(bào)告時(shí)間,在CRE的監(jiān)測(cè)調(diào)查中發(fā)揮良好作用,適用于臨床實(shí)踐中展開(kāi)推廣。