應(yīng)俊 王衛(wèi)忠 趙釗 呂火烊

2022年發(fā)布的全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)287萬，已經(jīng)成為全球第一大癌癥[1]。在中國女性中，乳腺癌死亡人數(shù)排在癌癥第4位，而在美國乳腺癌死亡人數(shù)已經(jīng)攀升至第2位[2]。隨著乳腺癌發(fā)病率和死亡率不斷提升，乳腺癌防治日益得到各個(gè)國家的重視。近年來，免疫治療在癌癥治療領(lǐng)域中開展得如火如荼，已成為治療乳腺癌在內(nèi)多種癌癥的有效方法[3-5]。然而，由于腫瘤異質(zhì)性及微環(huán)境的影響，只有部分患者能從免疫治療中獲益。因此，尋找乳腺癌特定的免疫相關(guān)生物標(biāo)志物并發(fā)現(xiàn)新的免疫治療靶點(diǎn)，在個(gè)體化免疫治療方案選擇、改善患者預(yù)后等方面具有重要意義。

泛素結(jié)合酶E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C，UBE2C）作為泛素偶聯(lián)酶E2家族成員，在泛素化依賴性蛋白水解中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而參與了包括細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化在內(nèi)的多種細(xì)胞進(jìn)程[6]。研究顯示，UBE2C在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，抑制UBE2C的表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的生長[7]。UBE2C與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，UBE2C過表達(dá)可能通過促進(jìn)耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性增加[8]。而且，UBE2C與乳腺癌的病理分級和復(fù)發(fā)等密切相關(guān)，在乳腺癌的早期診斷以及預(yù)后評估方面都具有重要的臨床意義[9]。總之，UBE2C在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，但UBE2C與乳腺癌的腫瘤微環(huán)境及免疫治療之間關(guān)系的研究較少，是否可以作為乳腺癌的免疫治療相關(guān)標(biāo)志物還有待進(jìn)一步的研究。本研究采用癌癥基因組圖譜（The Can‐cer Genome Atlas，TCGA）等數(shù)據(jù)庫綜合分析UBE2C在乳腺癌中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的關(guān)系，探討其與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系，以闡明UBE2C在乳腺癌免疫治療中的作用。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)提取、差異及生存分析從TCGA中提取1 066例乳腺癌組織及112例癌旁正常乳腺組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床病理特征，患者年齡45～71歲，男12例，女1 054例。對數(shù)據(jù)預(yù)處理后，提取UBE2C的表達(dá)數(shù)據(jù)，比較乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織之間UBE2C表達(dá)水平的差異。按照UBE2C的表達(dá)水平將乳腺癌患者分為UBE2C高表達(dá)組533例與UBE2C低表達(dá)組533例，利用R包“survival”比較兩組乳腺癌患者總生存期（overall survival，OS）的差異。

1.2 UBE2C共表達(dá)基因分析及UBE2C高低表達(dá)組間差異基因篩選通過Pearson相關(guān)進(jìn)行基因共表達(dá)分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為r＞0.6且P＜0.001，并對共表達(dá)結(jié)果進(jìn)行可視化。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較UBE2C高表達(dá)組與低表達(dá)組之間的差異基因，篩選錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05且兩組間樣本表達(dá)水平比值的對數(shù)絕對值（|log2Fold change|，|log2FC|）＞1的基因作為差異基因，并進(jìn)行可視化。

1.3 差異基因的功能注釋和富集分析利用R包“clusterProfiler”對UBE2C高表達(dá)組與低表達(dá)組間的差異基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，以探索差異基因的生物學(xué)功能及主要富集的信號通路，從通路來了解UBE2C在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的功能。

1.4 免疫細(xì)胞浸潤分析利用R包“CIBERSORT”計(jì)算每個(gè)腫瘤樣本中免疫細(xì)胞的豐度，評估免疫細(xì)胞浸潤水平，比較UBE2C高表達(dá)組與低表達(dá)組間免疫細(xì)胞浸潤的差異。

1.5 UBE2C表達(dá)與腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation bur‐den，TMB）、免疫檢查點(diǎn)基因的相關(guān)性分析使用R包“maftools”計(jì)算乳腺癌每個(gè)樣本中每百萬堿基中的腫瘤突變數(shù)得到TMB。通過Spearman秩相關(guān)分析UBE2C與TMB、文獻(xiàn)檢索所得常見免疫檢查點(diǎn)基因的關(guān)系。

1.6 UBE2C表達(dá)與乳腺癌免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性分析通過癌癥免疫組圖譜數(shù)據(jù)庫（The Cancer Immu‐nome Atlas，TCIA）下載乳腺癌免疫組數(shù)據(jù)，量化腫瘤免疫原性和分析腫瘤免疫景觀來預(yù)測乳腺癌的免疫治療反應(yīng)，通過數(shù)據(jù)庫中患者的免疫治療得分（immu‐nophenoscore，IPS）可以預(yù)測患者對細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）及程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）抑制劑為代表的免疫治療反應(yīng)差異。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較UBE2C高表達(dá)組與低表達(dá)組乳腺癌患者間IPS的差異。

1.7 外部數(shù)據(jù)驗(yàn)證UBE2C在乳腺癌中的作用使用TNM plot網(wǎng)絡(luò)工具（https://tnmplot.com）中的乳腺癌芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證UBE2C在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的差異。使用Kaplan-Meier Plotter在線工具（https://kmplot.com/analysis/）中的乳腺癌芯片數(shù)據(jù)評估UBE2C對乳腺癌患者生存的影響。利用蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫（The Human Protein Atlas，HPA）提供的免疫組化信息，在蛋白水平驗(yàn)證UBE2C在乳腺癌組織及正常乳腺組織中表達(dá)水平的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用R 4.0.3統(tǒng)計(jì)軟件。乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織間UBE2C的表達(dá)差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。UBE2C高表達(dá)組與UBE2C低表達(dá)組之間的差異基因篩選及免疫治療反應(yīng)的差異采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用對數(shù)秩和檢驗(yàn)比較組間OS的差異。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)或Spearman秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中UBE2C表達(dá)及預(yù)后分析通過比較TCGA數(shù)據(jù)庫中UBE2C在乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，UBE2C在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常乳腺組織（P＜0.01），見圖1A。UBE2C高表達(dá)組患者的OS明顯短于低表達(dá)組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。

圖1 乳腺癌中UBE2C表達(dá)及預(yù)后分析（A：乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中UBE2C表達(dá)差異，aP＜0.05；B：乳腺癌患者UBE2C高低表達(dá)組生存曲線的比較）

2.2 乳腺癌中UBE2C的功能分析共表達(dá)分析篩選出了乳腺癌中與UBE2C相關(guān)的基因，與UBE2C呈正相關(guān)的前6個(gè)基因分別為BIRC5、AURKB、TPX2、PTTG1、MYBL2、TROAP，與UBE2C呈負(fù)相關(guān)的前5個(gè)基因分別為CRY2、CYBRD1、KIF13B、NOSTRIN、WBP1L，見圖2A（插頁）。

圖2 乳腺癌中UBE2C的功能分析（A：乳腺癌中UBE2C共表達(dá)基因；B：UBE2C高低表達(dá)組差異基因熱圖；C：差異基因GO分析；D：差異基因KEGG信號通路富集分析）

通過差異分析，UBE2C高表達(dá)組與低表達(dá)組間共篩選得到2 691個(gè)差異基因，其中1 478個(gè)基因的表達(dá)量在UBE2C高表達(dá)組中較UBE2C低表達(dá)組低，1 213個(gè)基因的表達(dá)水平在UBE2C高表達(dá)組中較UBE2C低表達(dá)組高，UBE2C高低表達(dá)組間上下調(diào)差異最明顯的前50個(gè)基因熱圖見圖2B（插頁）。并對得到的2 691個(gè)差異基因進(jìn)行GO、KEGG分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因可能在細(xì)胞的增殖、分裂和細(xì)胞因子活性及趨化因子活性中發(fā)揮重要作用，見圖2C（插頁）。KEGG信號通路主要富集在細(xì)胞因子相關(guān)的信號通路及IL-17相關(guān)信號通路，見圖2D（插頁）。

2.3 乳腺癌中UBE2C與免疫細(xì)胞浸潤、TMB、免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性分析免疫細(xì)胞浸潤分析發(fā)現(xiàn)，UBE2C高表達(dá)組中幼稚B細(xì)胞、靜止的CD4記憶T細(xì)胞、單核細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、靜止的樹突狀細(xì)胞、靜止的肥大細(xì)胞的浸潤水平均明顯低于UBE2C低表達(dá)組，而活化的CD4記憶T細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞、T調(diào)節(jié)細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞的浸潤水平均明顯高于UBE2C低表達(dá)組（均P＜0.01），見圖3A（插頁）；UBE2C與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析見圖3B（插頁），UBE2C與M1巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞呈正相關(guān)，與M2巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。乳腺癌中UBE2C的表達(dá)與TMB呈正相關(guān)，見圖3C（插頁）。免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性分析見圖3D（插頁），UBE2C與CTLA-4、LAG3和IDO1等免疫檢查點(diǎn)呈正相關(guān)，與NRP1、CD220等基因呈負(fù)相關(guān)。

圖3 乳腺癌中UBE2C與免疫功能相關(guān)性分析（A：UBE2C高低表達(dá)組中浸潤免疫細(xì)胞差異柱狀圖，aP＜0.01；B：UBE2C與腫瘤微環(huán)境中浸潤免疫細(xì)胞的相關(guān)性棒棒糖圖；C：UBE2C與TMB相關(guān)性的散點(diǎn)圖；D：UBE2C與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性熱圖）

2.4 乳腺癌中UBE2C與免疫治療反應(yīng)相關(guān)性分析UBE2C高表達(dá)組對單獨(dú)抗PD-1、抗CTLA-4的免疫治療反應(yīng)較UBE2C低表達(dá)組敏感，并且抗PD-1和抗CTLA-4的聯(lián)合治療顯著改善了抗PD-1和抗CTLA-4單獨(dú)治療的治療反應(yīng)，見圖4。

圖4 乳腺癌UBE2C高低表達(dá)組免疫治療反應(yīng)差異（A：UBE2C高低表達(dá)組間CTLA-4負(fù)反應(yīng)和PD-1負(fù)反應(yīng)的IPS差異分析；B：UBE2C高低表達(dá)組間CTLA-4負(fù)反應(yīng)和PD-1正反應(yīng)的IPS差異分析；C：UBE2C高低表達(dá)組間CTLA-4正反應(yīng)和PD-1負(fù)反應(yīng)的IPS差異分析；D：UBE2C高低表達(dá)組間CTLA-4正反應(yīng)和PD-1正反應(yīng)的IPS差異分析）

2.5 乳腺癌芯片數(shù)據(jù)與免疫組化驗(yàn)證UBE2C在乳腺癌組織中的作用乳腺癌芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果與TCGA的乳腺癌測序分析結(jié)果一致，UBE2C在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常乳腺組織，并且UBE2C基因高表達(dá)組患者的OS明顯短于低表達(dá)組患者。通過HPA數(shù)據(jù)庫分析UBE2C蛋白在癌旁正常乳腺組織與乳腺癌組織中表達(dá)水平的差異，與TCGA的UBE2C mRNA的表達(dá)水平一致，乳腺癌組織中UBE2C的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常乳腺組織，見圖5（插頁）。

圖5 乳腺癌芯片數(shù)據(jù)與免疫組化驗(yàn)證UBE2C在乳腺癌組織中的作用（A：TNM plot中的芯片數(shù)據(jù)研究乳腺癌組織與癌旁正常乳腺組織中UBE2C的表達(dá)差異；B：Kaplan-Meier Plotter中的芯片數(shù)據(jù)研究UBE2C在乳腺癌中的生存分析；C：UBE2C蛋白在癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)，免疫組化染色，×40；D：UBE2C蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)，免疫組化染色，×40）

3 討論

泛素化是細(xì)胞內(nèi)靶蛋白降解的重要機(jī)制，對調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞程序性死亡、轉(zhuǎn)錄及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要的作用［10］。UBE2C是泛素－蛋白酶體通路中的重要組成部分，在與腫瘤抑制基因和癌基因編碼的蛋白降解有關(guān)的泛素蛋白酶途徑中起著關(guān)鍵性作用。研究表明，在乳腺癌中UBE2C呈現(xiàn)高表達(dá)，導(dǎo)致癌癥中的染色體錯(cuò)誤分離和不受控制的細(xì)胞周期[11-12]。本研究通過生物信息學(xué)方法評估了TCGA數(shù)據(jù)庫乳腺癌中的UBE2C表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與癌旁正常乳腺組織相比，乳腺癌中的UBE2C表達(dá)水平明顯增加，并且TNM plot中的乳腺癌基因芯片數(shù)據(jù)與HPA數(shù)據(jù)庫中的免疫組化結(jié)果與TCGA測序數(shù)據(jù)一致。這些結(jié)果表明，UBE2C表達(dá)水平可作為乳腺癌的潛在診斷指標(biāo)。為了確認(rèn)UBE2C是否可以用作預(yù)后生物標(biāo)志物，筆者通過TCGA乳腺癌測序數(shù)據(jù)與Kaplan-Meier Plot‐ter數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌芯片數(shù)據(jù)分析了UBE2C表達(dá)與OS之間的關(guān)系。分析結(jié)果表明，較高的UBE2C表達(dá)與乳腺癌較差的OS相關(guān)，表明UBE2C在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的重要性。通過對UBE2C共表達(dá)基因及UBE2C高低表達(dá)組差異基因分析，發(fā)現(xiàn)UBE2C高低表達(dá)組之間的基因表達(dá)存在顯著差異，而且與UBE2C相關(guān)的差異基因主要富集在細(xì)胞因子相關(guān)信號通路等免疫通路上，提示UBE2C可能在乳腺癌的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可作為乳腺癌免疫治療潛在的生物標(biāo)志物。

乳腺癌的腫瘤微環(huán)境包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)[13]。腫瘤微環(huán)境內(nèi)浸潤的免疫細(xì)胞不但影響腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展，還在腫瘤免疫治療反應(yīng)中起著重要作用[14-15]。通過免疫細(xì)胞浸潤分析，結(jié)果證實(shí)了UBE2C基因與腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞的相關(guān)性。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞可以極化為兩種類型：M1和M2。M1型巨噬細(xì)胞可以通過吞噬作用及介導(dǎo)Th1應(yīng)答來殺死腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長；而M2型巨噬細(xì)胞則通過產(chǎn)生細(xì)胞因子及介導(dǎo)Th2應(yīng)答，促進(jìn)組織修復(fù)、血管形成、產(chǎn)生免疫抑制，進(jìn)一步助長了腫瘤的演進(jìn)[16-17]。筆者通過免疫細(xì)胞浸潤分析發(fā)現(xiàn)UBE2C高表達(dá)組中發(fā)揮免疫抑制及促腫瘤作用的M2巨噬細(xì)胞明顯降低，而抑制腫瘤進(jìn)展的M1巨噬細(xì)胞明顯增加，表明UBE2C可能通過影響腫瘤微環(huán)境內(nèi)的M1/M2巨噬細(xì)胞比例在乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用。然而，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來揭示UBE2C調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤的潛在機(jī)制。

近年來，乳腺癌的免疫治療取得了巨大進(jìn)步，但缺乏能夠精準(zhǔn)預(yù)測免疫治療療效生物標(biāo)志物[18]。因此，需要進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)和臨床研究，以提高免疫治療的療效，并找到能夠預(yù)測免疫治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物，以達(dá)到“個(gè)體化”的免疫治療效果。UBE2C基因的表達(dá)或拷貝數(shù)變化會(huì)影響腫瘤微環(huán)境，可能在腫瘤的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。為了探索UBE2C預(yù)測乳腺癌患者免疫治療反應(yīng)的可能性，筆者評估了UBE2C與免疫檢查點(diǎn)基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)UBE2C與多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)具有相關(guān)性，可能在乳腺癌免疫治療中發(fā)揮重要作用。TMB是指每百萬堿基中被檢出發(fā)生體細(xì)胞突變的總數(shù)。由于腫瘤體細(xì)胞突變而產(chǎn)生的新抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。TMB是一種新興的預(yù)測免疫治療效果的指標(biāo)。TMB高的患者在體內(nèi)產(chǎn)生大量的抗原，對免疫治療具有更大的臨床益處。有研究指出，在高TMB的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，免疫治療反應(yīng)性更好，但是難以定義的TMB界值是限制相關(guān)研究推進(jìn)的因素之一[19]。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中UBE2C的表達(dá)與TMB呈正相關(guān)，表明UBE2C基因與乳腺癌免疫治療之間的相關(guān)性。免疫治療反應(yīng)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)UBE2C高表達(dá)組對免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗PD-1和抗CTLA-4的治療反應(yīng)較UBE2C低表達(dá)患者更加敏感，表明UBE2C在乳腺癌的免疫治療中起著重要作用，顯示了UBE2C在預(yù)測乳腺癌免疫治療反應(yīng)方面的潛力。

綜上所述，通過綜合生物信息學(xué)分析，本研究發(fā)現(xiàn)UBE2C可以作為乳腺癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物，并且可以用來評估乳腺癌患者的免疫狀態(tài)，可以根據(jù)UBE2C的表達(dá)對患者進(jìn)行分層，在治療前預(yù)測免疫治療的有效性，以此為依據(jù)選擇個(gè)體化的免疫治療方案。