張潔 楊華軍 趙偉 蔣巧平 李敏 胡勝杰

皮膚創(chuàng)傷破壞了皮膚的屏障功能及生理功能，尋找促進皮膚創(chuàng)面愈合的方法一直以來是臨床工作的重要內(nèi)容。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)及組織再生醫(yī)學(xué)有一定效果[1]。牙齦間充質(zhì)干細胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）是從牙齦組織中分離出來的MSCs，與其他干細胞比較，具有取材方便，擴增能力強的優(yōu)點，已證實用于牙周組織再生領(lǐng)域可發(fā)揮重要作用[2]。但調(diào)控這一生物學(xué)過程的內(nèi)在機制并不明確。近年來隨著對干細胞的深入研究，發(fā)現(xiàn)MSCs發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要途徑與其旁分泌能力有關(guān)[3]。本研究將不同濃度的人牙齦間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)液（human gingival mesenchymal stem cells derived conditioned medium，GM‐SCs-CM）作用于成纖維細胞，探討其對成纖維細胞生物學(xué)功能的影響，旨在為其用于促進皮膚創(chuàng)傷愈合的治療提供實驗和基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑及儀器DMEM培養(yǎng)基（美國Gib‐co公司）；基礎(chǔ)培養(yǎng)基（上海賽百慷公司）；0.25%胰蛋白酶（美國Sigma公司）；青霉素-鏈霉素、PBS（上海源培生物科技有限公司）；CO2培養(yǎng)箱、4℃離心機（型號：ST16R）（美國Thermo公司）；SupersmartTM2×快速SYBR Green qPCR預(yù)混液、SupersmartTM6 min耐熱首鏈cDNA合成試劑盒、SupersmartTM6 min高純RNA提取試劑盒、SupersmartTMCell Counting Kit-8[中實基因科技（天津）有限公司]；引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]；倒置熒光顯微鏡（天津微儀光學(xué)儀器有限公司）；LC96 qPCR儀（瑞士Roche公司）；CMax Plus酶標(biāo)儀（SpectraMax）。

1.2 方法

1.2.1 細胞來源和培養(yǎng)GMSCs購自賽百慷生物技術(shù)股份有限公司，使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，實驗選用第3～4代細胞。人成纖維細胞為重慶醫(yī)科大學(xué)贈送，使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，實驗選用第5代細胞。

1.2.2 GMSCs-CM制備將5×105個GMSCs接種在T25培養(yǎng)瓶中，用含血清替代物、血小板裂解物的生長培養(yǎng)基5 mL培養(yǎng)，2～3 d換液1次；當(dāng)培養(yǎng)的細胞達80%融合時，去除原培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，加入無添加劑的GMSCs基礎(chǔ)培養(yǎng)基5 mL；培養(yǎng)48 h后收集細胞上清液于15 mL離心管中，500 r/min離心5 min，使用0.22 μm孔徑濾過膜過濾，即得到GMSCs-CM；將收集到的GMSCs-CM采用Millpore超濾離心管濃縮（5 000 r/min，40 min，4℃），通過nanodrop儀測定濃度以備用。

1.2.3 細胞增殖實驗采用CCK-8法。取對數(shù)生長期的人成纖維細胞，按2×104個/孔、100 μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，24 h后棄去培養(yǎng)液，分別用1、5、10、50、100 μg/mL濃度的GMSCs-CM進行細胞處理，每個濃度3個復(fù)孔，同時設(shè)置GMSCs-CM添加0 μg/mL為空白對照組，CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄去培養(yǎng)基，加入10 μL/孔CCK-8溶液，置于37℃、5% CO2的細胞箱孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度（optical density，OD）值。

1.2.4 細胞凋亡實驗采用TUNEL法。將成纖維細胞按0.5×105個/mL密度接種在96孔板內(nèi)，100 μL/孔。細胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基，24 h后棄去培養(yǎng)液，加入0（空白對照組）、1、10、100 μg/mL濃度的GMSCs-CM，每個濃度3個復(fù)孔，孵育72 h后棄去上清液，PBS清洗細胞2次，采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，凋亡細胞呈現(xiàn)綠色熒光信號。

1.2.5 Ⅰ型膠原（type I collagen，COL-1）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）mRNA的檢測采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法。將成纖維細胞按照105個/mL密度接種于24孔板上貼壁培養(yǎng)24 h，加入0（空白對照組）、1、10、100 μg/mL濃度的GMSCs-CM，孵育24 h后棄去培養(yǎng)液，20 μL PBS重懸，按照RNA提取試劑盒的操作提取總RNA，在50℃5 min進行第一鏈cDNA合成，95℃1 min進行反轉(zhuǎn)錄失活反應(yīng)，得到cDNA進行qRT-PCR檢測COL-1、PCNA、α-SMA、TGF-β mRNA。相關(guān)基因的引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR中的引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0及GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GMSCs-CM對成纖維細胞增殖能力的影響不同濃度GMSCs-CM作用下的OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.163，P＜0.05）；1 μg/mL組成纖維細胞的增殖能力明顯高于空白對照組（P＜0.05），與空白對照組比較，GMSCs-CM濃度是5、10、50、100 μg/mL時也能促進成纖維細胞增殖，但是差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖1（插頁）、表2。

圖1 1 μg/mL GMSCs-CM作用72 h后成纖維細胞生長情況

表2 不同濃度GMSCs-CM作用下成纖維細胞增殖情況

2.2 GMSCs-CM對成纖維細胞凋亡情況的影響與空白對照組比較，成纖維細胞在不同濃度的GMSCs-CM作用下，細胞未發(fā)生明顯的凋亡，見圖2（插頁）。

圖2 不同濃度GMSCs-CM作用下成纖維細胞凋亡情況

2.3 不同濃度GMSCs-CM作用下成纖維細胞COL-1、PCNA、α-SMA、TGF-β mRNA表達水平的比較與空白對照組比較，GMSCs-CM濃度為1 μg/mL時COL-1 mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而隨著GMSCs-CM濃度的升高，COL-1 mRNA表達水平呈下降趨勢。GMSCs-CM濃度為1 μg/mL時PCNA mRNA表達水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而不同濃度GMSCs-CM作用下成纖維細胞α-SMA mRNA表達水平均低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。GMSCs-CM濃度為1 μg/mL時TGF-β mRNA表達水平高于空白對照組，而其他濃度作用下表達水平均低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度GMSCs-CM作用下成纖維細胞COL-1、PCNA、α-SMA、TGF-β mRNA表達水平的比較

3 討論

皮膚創(chuàng)面愈合對維持皮膚完整性和功能性起至關(guān)重要的作用。MSCs在皮膚創(chuàng)面修復(fù)及組織再生醫(yī)學(xué)中取得了一定的效果，是目前臨床中最有價值的醫(yī)療手段。GMSCs是從牙齦中分離出的MSCs，較其他來源的成體干細胞取材方便，同時臨床中發(fā)現(xiàn)，口腔黏膜的自身修復(fù)速度比皮膚修復(fù)速度快且很少形成瘢痕，推斷這與GMSCs的生物學(xué)特性相關(guān)，但調(diào)控這一生物學(xué)過程的內(nèi)在機制并不明確。近年來隨著干細胞的深入研究顯示，MSCs發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要依靠其旁分泌能力，通過旁分泌攜帶特異性信息的傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)靶細胞的生物學(xué)狀態(tài)。MSCs-CM的使用避免了MSCs移植產(chǎn)生的免疫原性高、致瘤和致畸風(fēng)險、直接注射會造成血管栓塞等不良反應(yīng)，相比MSCs移植更加安全方便，更具有臨床轉(zhuǎn)化前景?；诖?，筆者推測旁分泌也是GMSCs發(fā)揮修復(fù)作用的重要媒介。本研究通過使用不同濃度的GMSCs-CM作用成纖維細胞發(fā)現(xiàn)，GMSCs-CM對成纖維細胞的增殖能力有明顯的促進作用，而對細胞凋亡無明顯影響。

皮膚創(chuàng)面愈合過程涉及到炎細胞浸潤、不同細胞的相互作用、細胞外基質(zhì)的沉積和重塑、上皮的再生等，其中成纖維細胞在皮膚創(chuàng)面愈合中的調(diào)節(jié)作用占主導(dǎo)地位[4]。在創(chuàng)面愈合初期炎細胞浸潤，起主要作用的中性粒細胞、巨噬細胞分泌炎癥因子如TGF、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等來作為趨化劑招募組織形成階段所需的細胞和細胞因子，成纖維細胞募集到創(chuàng)面后在細胞因子的調(diào)節(jié)下進行肉芽組織的生成、血管的形成與上皮的再生[5]。

正常皮膚中的成纖維細胞數(shù)量基本恒定，皮膚損傷后，成纖維細胞生長快速地由G0期進入增殖期，以促進再生上皮化的進程從而加速創(chuàng)面的愈合[6]。本實驗研究表明，GMSCs-CM能顯著促成纖維細胞的增殖，以此影響創(chuàng)面愈合的再生上皮化過程。

合成COL-1的能力是成纖維細胞的典型特征，COL-1也是細胞外基質(zhì)的主要成分，約占其比重的70%。在正常成人皮膚中，膠原蛋白Ⅰ與膠原蛋白Ⅲ的比例約為4∶1，在新愈合的人體皮膚中，膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的比例約為1∶1[7]。本實驗研究結(jié)果顯示，在皮膚創(chuàng)面愈合過程中，GMSCs-CM不同濃度作用下成纖維細胞COL-1 mRNA表達水平均升高；同時發(fā)現(xiàn)GMSCs-CM能有效增加COL-1的表達，促進成纖維細胞的增殖，從而加速傷口愈合，且GM‐SCs-CM濃度為1 μg/mL時COL-1 mRNA表達水平最高，而隨著GMSCs-CM濃度的升高，COL-1 mRNA表達水平呈下降趨勢，提示1 μg/mL GMSCs-CM濃度是增加COL-1的表達促進成纖維細胞增殖的最適濃度。

TGF-β是創(chuàng)面愈合生理學(xué)中的一組關(guān)鍵細胞因子，它全程參與調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合過程的3個階段：（1）在傷口愈合早期，TGF-β由免疫細胞分泌，充當(dāng)免疫細胞的化學(xué)引誘物，調(diào)節(jié)免疫細胞功能，從而有助于炎癥消退；（2）在組織形成期，TGF-β通過刺激內(nèi)皮細胞遷移、分化和毛細血管形成來促進血管生成[8]，同時還刺激成纖維細胞增殖，促進成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，并刺激細胞外基質(zhì)產(chǎn)生，促進再生上皮化；（3）基質(zhì)重塑階段，TGF-β通過一系列嚴格調(diào)控，使得細胞外基質(zhì)合成和降解維持平衡狀態(tài)。PCNA是DNA復(fù)制和修復(fù)的重要因素，作為評價細胞增殖狀態(tài)的重要指標(biāo)，已證實在皮膚組織的發(fā)生和修復(fù)過程中表達增強[9]。本研究中也發(fā)現(xiàn)，1 μg/mL GMSCs-CM可促進TGF-β mRNA和PCNA mRNA的表達水平。

傷口愈合的中后期，成纖維細胞由原型肌成纖維細胞分化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞是表達α-SMA的特化細胞[10]，它響應(yīng)TGF的刺激并促進創(chuàng)面的收縮，使肉芽組織纖維化[11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，GMSCs-CM組細胞α-SMA mRNA表達水平均低于空白對照組，隨著GMSCs-CM濃度的增加，α-SMA mRNA表達水平也逐漸增加。提示在創(chuàng)面愈合過程中提高GMSCs-CM的濃度可導(dǎo)致成纖維細胞纖維化，從而促進皮膚創(chuàng)面的收縮。

綜上所述，GMSCs-CM含有大量GMSCs分泌的生物活性物質(zhì)，可調(diào)節(jié)成纖維細胞的生物活性狀態(tài)從而促進皮膚創(chuàng)面的愈合。同時，GMSCs-CM中細胞因子的濃度具有可調(diào)控性，若通過全身或者局部給藥的方式精準作用于皮膚創(chuàng)面，可使GMSCs-CM的使用更加安全更具有臨床轉(zhuǎn)化前景。在此過程中，COL-1和TGF-β表達調(diào)控的機制有待進一步闡明，或可成為創(chuàng)面愈合的潛在治療策略。