曹忠波，谷洋，張媛媛，劉曉晶，華正罡

（1.遼寧省疾病預(yù)防控制中心,遼寧省環(huán)境與人群健康監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽 110172；2.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)驗(yàn)證中心,沈陽 110033）

酰胺類除草劑主要用來防治一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草,對(duì)多種禾本科雙子葉植物有較強(qiáng)的殺毒作用[1]。廣泛應(yīng)用于玉米、花生、大豆、棉花等農(nóng)作物生產(chǎn)種植中,是目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的一類除草劑[2]。酰胺類除草劑的土壤吸附常數(shù)比較低,水溶性強(qiáng),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用后易轉(zhuǎn)移到地表水和淺層地下水中,對(duì)飲用水水源可能造成污染,進(jìn)而威脅人類飲水安全及健康[3]。

酰胺類除草劑進(jìn)入環(huán)境后,容易轉(zhuǎn)化為二烷基苯醌亞胺,可增加人和動(dòng)物發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。甲草胺和乙草胺已先后被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)署(EPA)列為B-2 類致癌物[6]。近年來,酰胺類除草劑在環(huán)境樣品中殘留的關(guān)注度逐漸提高。于志勇等[7]采用固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法調(diào)查了我國(guó)一些主要城市的水源水和出廠水中的除草劑乙草胺殘留水平。結(jié)果表明,水源水中乙草胺的檢出率為66.9%,乙草胺的污染比較普遍。從區(qū)域上看,東北地區(qū)的平均檢出濃度遠(yuǎn)高于西北和西南地區(qū)；從水源類型上看,湖庫型和河流型水源水中乙草胺濃度遠(yuǎn)高于地下型水源,污染嚴(yán)重。我國(guó)現(xiàn)行GB/T 5750—2006《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》中還沒有針對(duì)8種酰胺類除草劑建立檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。因此,建立一個(gè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高檢測(cè)方法,對(duì)水源水的污染狀況評(píng)價(jià)及人體飲用水健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究有積極幫助。

目前,酰胺類除草劑農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要有氣相色譜(GC)法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)法[10]、高效液相色譜 (HPLC)法[11]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (LC-MS/MS)法[12]等。氣相色譜法和高效液相色譜法用于定性分析時(shí)容易出現(xiàn)結(jié)果假陽性、方法的檢測(cè)靈敏度低等問題。串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)法有更精準(zhǔn)的選擇性、特異性,能有效地降低噪音,提高信噪比,從而提高靈敏度和測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度,避免假陽性或者假陰性的結(jié)果,可以很好的解決應(yīng)用GC、LC、GC-MS 法檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)樣品中多種酰胺類除草劑遇到的問題。

筆者采用固相萃取凈化技術(shù)(SPE)對(duì)大體積水體樣本進(jìn)行富集、凈化,并用氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜 (GC-MS/MS)儀進(jìn)行檢測(cè),建立生活飲用水中酰胺類除草劑的快捷、高效、準(zhǔn)確的分析方法,以滿足生活飲用水中多種酰胺類除草劑殘留的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：GC-7890+MS/MS-7000B型 ,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

氮吹儀：Turbo VapⅡ型,美國(guó) Caliper公司。

超純水機(jī)：IQ7000型,美國(guó)密理博公司。

自動(dòng)固相萃取儀：Sepaths-10型,北京萊伯泰科儀器有限公司。

分析天平：XS205,感量為0.1 mg,瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

C18固相萃取小柱：6 mL/500 mg,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

氨基固相萃取小柱：6 mL/500 mg,美國(guó)安捷倫科技有限公司。

HLB 固相萃取小柱：6 mL/500 mg,美國(guó)沃特世公司。

酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)樣品：毒草胺（純度不小于99.6%）、乙草胺（純度不小于97.9%）、甲草胺（純度不小于99.9%）、異丙甲草胺（純度不小于98.5%）、雙苯酰草胺（純度不小于98.5%）、丁草胺（純度不小于96.3%）、敵草胺（純度不小于99.8%）、丙草胺（純度不小于99.8%）,德國(guó)DR.Ehrenstorfer GmbH公司。

環(huán)氧七氯B：純度不小于99.3%,德國(guó)DR.Ehrenstorfer GmbH公司。

二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、正己烷：均為色譜純,美國(guó)Fisher公司。

無水硫酸鈉：分析純,經(jīng)450 ℃烘烤2 h,置于干燥器內(nèi)備用,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

8 種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL,準(zhǔn)確稱取8種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)樣品各10.0 mg于10 mL容量瓶中,加入丙酮溶解并定容至標(biāo)線。于4 ℃冰箱中避光保存,于6 個(gè)月內(nèi)使用。

8 種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：各組分質(zhì)量濃度均為1.00 mg/L,用丙酮將8 種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋、定容,置于冰箱中避光保存,于1個(gè)月內(nèi)使用。

環(huán)氧七氯B 標(biāo)準(zhǔn)溶液：20.0 mg/L,準(zhǔn)確稱取環(huán)氧七氯B 10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)樣品于10 mL容量瓶中,加入丙酮溶解,定容至標(biāo)線,取溶液適量,再用丙酮稀釋至50 倍體積,于4 ℃冰箱中避光保存,于1 個(gè)月內(nèi)使用。

氮?dú)猓杭兌炔恍∮?9.999%,沈陽廣泰氣體有限公司。

氦氣：純度不小于99.999%,沈陽廣泰氣體有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水：經(jīng)超純水機(jī)制得,現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：HP-5MS UI 柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司）彈性石英毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：280 ℃。柱溫：初始溫度為85 ℃,以15 ℃/min 升溫至190 ℃,再以5 ℃/min 升溫至225 ℃,然后以20 ℃/min升溫至280 ℃,保持5 min；載氣：氦氣；柱流量：1.0 mL/min,恒流模式；進(jìn)樣模式：不分流；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

四級(jí)桿溫度：150 ℃；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；掃描時(shí)間：0.45 s；監(jiān)測(cè)掃描模式：MRM 模式；碰撞氣：氮?dú)?流量為1.5 mL/min；淬滅氣：氦氣,流量為2.25 mL/min；溶劑延遲：8 min；8種酰胺類除草劑保留時(shí)間、定量離子、定性離子和碰撞能量見表1。

表1 8種酰胺類除草劑保留時(shí)間、母離子、子離子和碰撞能量

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品采集與運(yùn)輸

用硬質(zhì)磨口棕色玻璃瓶采集樣品。每升水樣中加入約100 mg 抗壞血酸,注滿樣品瓶,上部不留有空間并加蓋密封,于4℃以下冷藏、避光保存和運(yùn)輸。采樣后在24 h內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行萃取,萃取后若不能及時(shí)測(cè)定,應(yīng)于4℃以下避光冷藏,7 d 內(nèi)完成分析測(cè)定。

1.3.2 樣品制備

將水樣于室溫放置,若水樣中有細(xì)小顆粒物而較為渾濁,可使用0.45 μm水系濾膜過濾,便于固相萃取柱萃取水樣品,防止堵塞。

固相萃取過程：依次用5 mL二氯甲烷、5 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇、10 mL純水以3 mL/min流量過柱活化。準(zhǔn)確量取500 mL 水樣,以15 mL/min 的流量過C18固相萃取柱。用氮?dú)獯蹈晒滔噍腿≈?去除水分。用5 mL乙酸乙酯以3 mL/min流速洗脫固相萃取小柱,并收集洗脫液。如果洗脫液中含有水分,再用無水硫酸鈉去除。將洗脫液置入氮?dú)鉂饪s儀中,于40 ℃下吹至近干。加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液,用乙酸乙酯復(fù)溶定容1.0 mL,上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 樣品測(cè)定

處理后的樣品溶液上機(jī)測(cè)定,以保留時(shí)間定性,色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 水樣pH值的選擇

文獻(xiàn)[13]報(bào)道,對(duì)水樣中半揮發(fā)性有機(jī)物的檢測(cè)過程中,可通過調(diào)節(jié)水樣的pH來提高化合物穩(wěn)定性及目標(biāo)化合物萃取效率。實(shí)驗(yàn)考察了以C18為固相萃取柱時(shí)pH分別為2、7時(shí)的樣品萃取效率,結(jié)果見圖1。結(jié)果表明,當(dāng)pH 7 時(shí)8 種酰胺類除草劑的回收率為80.7%～99.2%,均高于pH 2 時(shí)的回收率（47.8%～95.2%）,因此筆者最終選擇調(diào)節(jié)水樣pH 7進(jìn)行測(cè)定。

圖1 8種酰胺類除草在不同pH值條件下的回收率（n=6）

2.2 固相萃取柱選擇

選擇合適的吸附劑對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行富集及對(duì)干擾物質(zhì)進(jìn)行分離至關(guān)重要[14]。目前商品化的固相萃取柱種類繁多,主要根據(jù)目標(biāo)化合物理化性質(zhì)及基體中的主要雜質(zhì)種類進(jìn)行固相萃取柱的選擇。試驗(yàn)比較了C18、HLB及NH23種固相萃取小柱對(duì)樣品中目標(biāo)物的富集和凈化效果,對(duì)比目標(biāo)物的回收率,結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果表明,NH2柱和HLB 柱只有對(duì)雙苯酰草胺的回收率大于85%,另7 種酰胺類除草劑樣品回收率均低于80%,不能滿足實(shí)驗(yàn)要求。而經(jīng)C18柱萃取的樣品回收率為85.6%～103.5%,能滿足分析要求,因此選擇C18柱萃取樣品。

圖2 8種酰胺類除草在不同固相萃取條件下的回收率（n=6）

2.3 固相萃取柱活化及洗脫溶劑優(yōu)化

酰胺類除草劑均為中等極性,實(shí)驗(yàn)中8 種目標(biāo)化合物的極性具有一定差異。樣品溶液取得理想的凈化效果關(guān)鍵因素取決于合適洗脫溶液和洗脫體積。在洗脫階段,分別考察了4種溶劑及溶劑組合：5 mL 乙酸乙酯、5 mL 二氯甲烷、5 mL 乙酸乙酯-正己烷（體積比為1∶1）、5 mL 丙酮-正己烷（體積比為1∶1）進(jìn)行洗脫試驗(yàn),結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明,使用乙酸乙酯時(shí),C18固相萃取柱吸附的8種酰胺類除草劑回收率均較高（88.6%～102.5%）,故選擇用5 mL乙酸乙酯洗脫。

圖3 8種酰胺類除草在不同洗脫溶液下的回收率（n=6）

2.4 質(zhì)譜離子源溫度的優(yōu)化

質(zhì)譜離子源溫度是保證化合物離子化效率的關(guān)鍵因素之一。在一定范圍內(nèi)提高離子源溫度,可增加化合物的離子化效率,從而提高檢測(cè)靈敏度,還可以起到凈化保護(hù)離子源的作用,防止高沸點(diǎn)化合物的殘留[15]。分別設(shè)定離子源溫度為230、250、280 ℃,考察離子源溫度對(duì)8 種酰胺類除草劑的色譜峰面積的影響,結(jié)果見圖4。由圖4可知,毒草胺、異丙醇草胺、雙苯酰草胺3 種除草劑的色譜峰面積隨離子源溫度的升高顯著增大；乙草胺、甲草胺、丁草胺、敵草胺、丙草胺色譜峰面積提高不顯著。故選擇離子源溫度為280℃。

圖4 不同離子源溫度對(duì)應(yīng)的8種酰胺類除草劑色譜峰面積

2.5 色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

酰胺類除草劑的分子極性較弱,因此選擇極性較小的HP-5MS UI 彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）。優(yōu)化氣相色譜柱溫的升溫程序,使8 種酰胺類除草劑色譜峰峰形尖銳,對(duì)稱性好,具有良好的分離度。

先采用全掃描模式在m/z50～550 范圍內(nèi)對(duì)8種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,得到各種酰胺類除草劑的相對(duì)保留時(shí)間和質(zhì)譜圖。選擇分子離子峰或相對(duì)豐度較高的特征碎片峰作為母離子。再用離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,選擇豐度較高的合理斷裂碎片離子作為子離子。經(jīng)優(yōu)化最終確定8種酰胺類除草劑母離子、子離子和碰撞能量,結(jié)果見表1。圖5 為8 種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式總離子流圖,圖6 為空白樣品總離子流圖,圖7為加標(biāo)樣品總離子流圖。

圖5 8種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖（MRM）

圖6 空白樣品總離子流圖

圖7 加標(biāo)樣品加標(biāo)總離子流圖

2.6 線性范圍與檢出限

精確吸取一定量的8種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液,逐級(jí)用乙酸乙酯稀釋,配制成8 種酰胺類除草劑質(zhì)量濃度均為10～250 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以8種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值為橫坐標(biāo),除草劑定量離子色譜峰面積和內(nèi)標(biāo)物定量離子色譜峰面積的比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以3倍的信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法的檢出限,10倍的信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限。

8種除草劑組份線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及檢出限見表2。

表2 線性關(guān)系和方法檢出限

2.7 樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

在空白水樣中添加8種酰胺類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成低、中、高三個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品,每種濃度水平配制6 份樣品,按1.3 方法進(jìn)行處理測(cè)定,計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表3。由表3 可知,8 種酰胺類除草劑回收率為81.1%～104.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～6.3%,說明該方法準(zhǔn)確度和精密度符合農(nóng)藥殘留分析要求。

表3 3種濃度加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

建立了C18固相萃取柱富集、凈化生活飲用水樣品中8種酰胺類除草劑,利用氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)方法。該方法具有易操作、線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度和靈敏度高、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn),適用于生活飲用水中多種酰胺除草劑殘留檢測(cè)同時(shí)檢測(cè)。為評(píng)價(jià)水體污染狀況和人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等相關(guān)研究提供支持和幫助。