夏志騁，鐘杰，謝劍晨，黃靈潔，曹昌清，王穎

（上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站,上海 200082）

為了防止煙用水基膠生產(chǎn)加工和貯藏過程中發(fā)生霉變,通常會(huì)使用殺菌劑。殺菌劑對(duì)細(xì)菌、霉菌、藻類等具有很強(qiáng)的抑制和殺滅作用,是防止水基膠腐敗變質(zhì)最經(jīng)濟(jì)、最有效和最簡(jiǎn)潔的方法之一。煙用水基膠中常用的殺菌劑有異噻唑啉酮、山梨酸及苯甲酸以及部分含鹵素的殺菌劑。

異噻唑啉酮類殺菌劑是通過斷開細(xì)菌的藻類蛋白質(zhì)的鍵而起作用,是最有效的殺菌劑之一。但異噻唑啉酮類殺菌劑具有一定生物毒性,過量使用容易造成肝腎損傷,具且有一定致癌性。為了保證煙用產(chǎn)品的質(zhì)量安全,行業(yè)在2020年1月發(fā)布YQ 5—2019《煙用膠黏劑安全衛(wèi)生要求》,對(duì)異噻唑啉酮類殺菌劑進(jìn)行了明確限量[1]。異噻唑啉酮測(cè)定方法目前有液相色譜法[2-3]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-8]。

2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇（溴硝醇）,是一種廣泛高效的抗菌劑,對(duì)細(xì)菌的抑制效果好,且不受陰離子、陰離子表面活性劑以及蛋白質(zhì)的影響,屬于中等毒性化合物。在YQ 5—2019《煙用材料許可使用物質(zhì)名單》中,對(duì)溴硝醇含量有嚴(yán)格的限制。目前溴硝醇檢測(cè)方法集中在化妝品及造紙領(lǐng)域[9-10]。

苯甲酸及苯甲酸鹽類、山梨酸及山梨酸鹽類這兩類物質(zhì)主要通過抑制微生物體內(nèi)的脫氫酶系統(tǒng),從而達(dá)到抑制微生物和起到防腐的作用。這兩類防腐劑在各類食品中被廣泛使用。GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定苯甲酸及其鈉鹽、山梨酸及其鉀鹽在飲料、醬油、醋及果酒中的含量應(yīng)不大于1.0 g/kg,在《YQ15-煙用材料許可使用物質(zhì)名單》中暫無對(duì)這兩種物質(zhì)的限量要求,但監(jiān)控其使用情況對(duì)于保證人們身體健康具有重要意義。

在非YQ15 許可防腐劑中,尼泊金酯類也是廣泛應(yīng)用于各種食品和化妝品的殺菌防腐劑,主要破壞微生物的細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性,并能抑制細(xì)胞的呼吸酶活性,達(dá)到殺菌防腐的效果。此類殺菌防腐劑在部分歐洲搭口膠配方專用。

文獻(xiàn)報(bào)道殺菌劑中溴硝醇、苯甲酸及苯甲酸鹽類、山梨酸及山梨酸鹽類[11]、尼泊金酯[12-16]的主要測(cè)定方法有液相色譜法、氣相色譜法、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[17]等方法。相關(guān)檢測(cè)方法大都用于食品、造紙、化妝品行業(yè),且僅檢測(cè)其中一種或幾種殺菌劑。相較于常規(guī)的液相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜法,超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有良好定性、定量分析性能而成為同時(shí)測(cè)定殺菌劑的最佳方法。筆者建立一種樣品預(yù)處理方法,并利用超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)煙用水基膠中溴硝醇、尼泊金酯、異噻唑啉酮、苯甲酸及苯甲酸鹽類、山梨酸及山梨酸鹽類進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、同時(shí)檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：ACQUITY UPLC 型超高效液相色譜儀及Xevo TQ-XS 型串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀,美國(guó)沃特世公司。

超聲波發(fā)生器：Sono Swiss SW 45H 型,瑞士Sono公司。

高速離心機(jī)：RJ-LDL-50G型,無錫市瑞江分析儀器有限公司。

電子天平：XP205型,感量為0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多有限公司。

尼泊金甲酯（MP）、尼泊金乙酯（EP）、尼泊金丙酯（PP）、尼泊金丁酯（BP）：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.0%,美國(guó)Accustandard公司。

尼泊金異丙酯（IPP）、尼泊金異丁酯（IBP）、山梨酸（SA）：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.0%,日本梯希愛公司。

2-溴-2-硝基-1,3-丙二醇（溴硝醇,Bronopol,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%）、苯甲酸（BA,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%）、2-甲基-4-異噻唑啉-3酮（MI,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.6%）、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（CMI,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、1,2-苯并異噻唑-3-酮（BIT,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮（OIT,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.9%）,德國(guó)Dr.E公司。

4,5-二氯-N-辛基-4-異噻唑啉-3-酮（DCOIT）：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%,德國(guó)CNW公司。

BA-d5（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%）、MP-13C6（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、EP-13C6（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、PP-d4（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）、MI-d3（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%）,CMI-d3（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%）、BIT-13C6（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%）內(nèi)標(biāo)物：加拿大TRC公司。

甲醇：LC-MS級(jí),德國(guó)默克公司。

實(shí)驗(yàn)室用水由Milli-Q 超純水凈化處理系統(tǒng)制備,符合一級(jí)水要求。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取6種尼泊金酯（MP、EP、IPP、PP、BP、IBP）、BA、SA、Bronopol、5 種異噻唑啉酮（MI、CMI、BIT、OIT、DCOIT）標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇溶解并稀釋成BA、SA 質(zhì)量濃度均為10 μg/mL,Bronopol、MI、BIT 質(zhì)量濃度均為1 000 ng/mL,6 種尼泊金酯、CMI、OIT、DCOIT 質(zhì)量濃度均為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇將BA、SA配制成質(zhì)量濃度分別為25、50、100、250、500、1 000 ng/mL,Bronopol、MI、BIT 配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、25、50、100 ng/mL,6 種尼泊金酯、CMI、OIT、DCOIT 配制成質(zhì)量濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（其中內(nèi)標(biāo)BA-d5質(zhì)量濃度為100 ng/mL,MI-d3、CMI-d3、BIT-13C6質(zhì)量濃度為10 ng/mL,MP-13C6、EP-13C6、PP-d4質(zhì)量濃度為1 ng/mL）。

混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：分別稱取BA-d5、MP-13C6、EP-13C6、PP-d4、MI-d3,CMI-d3、BIT-13C6內(nèi)標(biāo)物適量,用甲醇溶解并稀釋成BA-d5質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL,MI-d3、CMI-d3、BIT-13C6質(zhì) 量 濃 度 為100 ng/mL,MP-13C6、EP-13C6、PP-d4質(zhì) 量 濃 度 為10 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

1.3 樣品預(yù)處理

稱取煙用水基膠約0.3 g于50 mL離心管中,用5 mL 水分散后再加入20 mL 甲醇,超聲萃取10 min,將50 mL離心管放入離心機(jī)后離心5 min（轉(zhuǎn)速為4 000 r/min）,然后將上清液用0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾,取50 μL 濾液加入100 μL 混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,再用甲醇稀釋至約1.0 mL,作為樣品溶液。

1.4 色譜條件

色 譜 柱：ACQUITY BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國(guó)沃特世科技有限公司)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動(dòng)相：A 相為水,B相為甲醇,流量為0.3 mL/min,梯度洗脫,洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子和負(fù)離子模式同時(shí)掃描；正離子噴霧電壓：3 kV；負(fù)離子噴霧電壓：2 kV；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣：氮?dú)?流量為1 000 L/h；霧化氣：氮?dú)?壓力為700 kPa；碰撞氣：氬氣,流量為0.15 mL/min；離子源溫度：150 ℃；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。優(yōu)化后的其它質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 特征選擇離子及質(zhì)譜參數(shù)

1.6 實(shí)驗(yàn)步驟

取1.2中混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及1.3中樣品溶液按1.4 色譜條件和1.5 質(zhì)譜條件進(jìn)行分析,以每種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo),以定量離子色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量離子色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)建立14種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算線性方程,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中14種物質(zhì)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

異噻唑啉酮類含雜環(huán)的物質(zhì)在PFP（五氟苯基）柱上保留良好,實(shí)驗(yàn)室通過比較ACQUITY UPLC HSS PFP（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）與ACQUITY BEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）發(fā)現(xiàn),五氟苯基柱雖能完好保留異噻唑啉酮類物質(zhì),但不能完全分離BP與異丁酯,故實(shí)驗(yàn)選用常規(guī)的C18柱。

選用水-甲醇為流動(dòng)相,當(dāng)在流動(dòng)相中單獨(dú)加入0.5 mmol/L 的甲酸或單獨(dú)加入2 mmol/L 的乙酸銨時(shí),雖然可以抑制樣品電離,但酸的加入,導(dǎo)致負(fù)離子掃描模式下,SA、BA 及Bronopol 質(zhì)譜信號(hào)被抑制。當(dāng)在流動(dòng)相中加入1 mmol/L氨水時(shí),BA及SA保留變差,且大幅抑制了正離子掃描模式下異噻唑啉酮的響應(yīng)。且在正、負(fù)離子模式下均采用水-甲醇為流動(dòng)相可以方便實(shí)驗(yàn)操作,不需要更換流動(dòng)相。因此最終確定選擇水-甲醇體系作為流動(dòng)相。6 種尼泊金酯、5種異噻唑啉酮、Bronopol、SA及BA色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用甲醇將6 種尼泊金酯、5 種異噻唑啉酮、Bronopol、SA及BA稀釋至質(zhì)量濃度均為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,通過針泵恒流進(jìn)樣方式注入質(zhì)譜儀,流量為5 μL/min。首先在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,確定目標(biāo)化合物的母離子[M+H]+。然后使用子離子掃描進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,確定目標(biāo)物的子離子信息,選擇干擾小、響應(yīng)值高的離子對(duì),以響應(yīng)值最高的碎片離子作為定量離子,次高的碎片離子作為定性離子。其次使用相同方法在負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描,確定目標(biāo)化合物的母離子[M-H]-。然后使用子離子掃描進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描。在負(fù)離子掃描過程中,由于BA 母離子在脫掉一個(gè)—COO-后形成的苯環(huán)非常穩(wěn)定,因此僅能找到一個(gè)信號(hào)非常強(qiáng)的子離子,故僅選擇一對(duì)離子對(duì)。SA 在確定母離子后,也僅能找到一個(gè)脫掉—COO-的子離子碎片峰,故這兩個(gè)化合物均只使用一對(duì)離子對(duì)。Bronopol在負(fù)離子模式下掃描過程中發(fā)現(xiàn),當(dāng)選用[M-H]-（質(zhì)荷比199）為母離子時(shí),改變碰撞能均無法得到其子離子,可能由于Bronopol 極易在溶液中脫去一個(gè)—CH2OH[10],故選擇m/z166為母離子。最終確定優(yōu)化好的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

根據(jù)待測(cè)物的理化性質(zhì)以及文獻(xiàn)報(bào)道,尼泊金酯類溶于醇、醚和丙酮,極微溶于水；Bronopol 易溶于水、醇,且在堿性水溶液中會(huì)緩慢分解；異噻唑啉酮類微溶于水,微溶于醇,在pH 2～12 時(shí)均可使用；SA、BA 呈弱酸性,溶于水、甲醇。實(shí)驗(yàn)分別考察純水、甲醇以及不同比例甲醇-水對(duì)樣品的萃取效果。

采用甲醇-水為流動(dòng)相,為保持與流動(dòng)相一致,故分別采用純水、甲醇、甲醇-水（體積比為20∶80、50∶50、80∶20）進(jìn)行提取。在使用甲醇溶解時(shí),水基膠溶液中出現(xiàn)絮狀物,振蕩后依然呈現(xiàn)團(tuán)狀物并有結(jié)塊現(xiàn)象,無法全部分散。各種體系提取效率結(jié)果如表3。結(jié)果表明,采用純水及甲醇-水（20∶80）溶劑進(jìn)行提取時(shí),發(fā)現(xiàn)DCOIT 的萃取效率較低,采用甲醇-水（80∶20）時(shí)各物質(zhì)萃取效率最高（78.4%～116.6%）,因此采用甲醇-水（80∶20）作為提取溶劑。

表3 使用不同提取溶劑時(shí)目標(biāo)物的提取效率 %

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

以實(shí)際空白樣品,采用基質(zhì)加標(biāo)法考察了不同稀釋倍數(shù)下各目標(biāo)合物的基質(zhì)效應(yīng)（ME）,即采用1.3樣品預(yù)處理方式,得到空白基質(zhì)液。配制質(zhì)量濃度為500 ng/mL 的SA、BA,50 ng/mL 的Bronopol、MI、BIT,5 ng/mL 的6 種 尼 泊 金 酯、CMI、OIT、DCOIT 的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各目標(biāo)物的色譜峰面積減去標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相應(yīng)濃度的各目標(biāo)物的色譜峰面積,再除以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相應(yīng)濃度的各目標(biāo)物的色譜峰面積,計(jì)算得基質(zhì)效應(yīng)值（ME）。ME 的正負(fù)分別表示基質(zhì)增強(qiáng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。當(dāng)|ME|小于20%時(shí),表示弱基質(zhì)效應(yīng),當(dāng)|ME|為20%～50%時(shí),表示中等基質(zhì)效應(yīng),當(dāng)|ME|大于50%時(shí),表示強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。不同稀釋倍數(shù)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)值如表4。由表4可知,當(dāng)將空白基質(zhì)溶液稀釋20倍后,各目標(biāo)物在基質(zhì)匹配工作溶液中的色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中相應(yīng)濃度的色譜峰面積相近,|ME|值均小于20%,為弱基質(zhì)效應(yīng),因此將預(yù)處理后的樣品稀釋至20 倍體積,并加入內(nèi)標(biāo),可最大程度減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

表4 不同稀釋倍數(shù)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)值

2.5 線性關(guān)系、檢出限與定量限

按照1.2配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè),以每種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo),以定量離子色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量離子色譜峰面積比值為縱坐標(biāo),繪制14種殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

以信噪比大于等于3計(jì)算目標(biāo)物在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù),作為方法檢出限（LOD）,以信噪比大于等于10計(jì)算方法定量限（LOQ）。

14種殺菌劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表5。由表5可知,14種殺菌劑在對(duì)應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均不小于0.998,檢出限為0.01～0.81 μg/g,定量限為0.03～2.69 μg/g,均滿足檢測(cè)要求。

表5 14種殺菌劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

選取一個(gè)空白煙用水基膠進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。設(shè)定低、中、高3個(gè)添加水平,每個(gè)添加水平做6個(gè)平行樣品,按該方法進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果列于表6,空白樣品及加標(biāo)樣品色譜圖如圖2～圖6。煙用水基膠中待測(cè)物平均加標(biāo)回收率為76.4%～125.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～12.2%,表明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

圖2 尼泊金酯空白與加標(biāo)樣品色譜圖

圖4 Bronopol空白與加標(biāo)樣品色譜圖

圖5 SA空白與加標(biāo)樣品色譜圖

圖6 BA空白與加標(biāo)樣品色譜圖

表6 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

3 結(jié)語

建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定煙用水基膠中6 種尼泊金酯、5 種異噻唑啉酮、溴硝醇、山梨酸、苯甲酸共14種殺菌劑的方法,采用內(nèi)標(biāo)法定量。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好、基質(zhì)效應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)?？稍谳^短時(shí)間內(nèi)同時(shí)完成14 種殺菌劑的定性和定量檢測(cè)。該方法為涉及煙用水基膠殺菌劑檢測(cè)提供了有力的技術(shù)支持。