羅春連

（福建省工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)許可證審查技術(shù)中心,福州 350003）

種茶、制茶和飲茶文化都起源于中國,千百年來,茶葉借由茶馬古道和海陸絲綢之路由中國傳播至世界各地,備受世界人民喜愛[1-2]。中國茶葉流通協(xié)會(huì)在《2021年中國茶葉產(chǎn)銷形勢報(bào)告》中指出,我國茶樹種植面積為4 896.09 萬畝,干毛茶總產(chǎn)量306.32萬噸,產(chǎn)值2 928.14億元,茶樹種植面積和茶葉市場消費(fèi)規(guī)模龐大,相比于往年均有所增加[3]。茶葉產(chǎn)銷規(guī)模取決于茶葉品質(zhì)[4],但茶葉在種植和儲(chǔ)藏過程中易受病蟲害的影響[5-7]。

溴甲烷是一種廣譜性熏蒸劑,對病菌[8]、昆蟲[9]、線蟲[10]、雜草[11]等病害生物的防治效果尤為顯著,也被用于茶葉的消毒[12]。但溴甲烷的使用不僅會(huì)破壞土壤微生態(tài)平衡,還會(huì)損耗臭氧層,上世紀(jì)末《蒙特利爾議定書》哥本哈根修正案就建議各締約國中發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家分別于2005 年和2015 年將其淘汰[13]。然而聯(lián)合國溴甲烷技術(shù)選擇委員會(huì)（Methyl Bromide Technical Options Committee,MBTOC）在對20 余種溴甲烷替代物進(jìn)行評估后發(fā)現(xiàn),溴甲烷的廣譜性消毒優(yōu)勢使其難以完全被替代,因此在一些必要用途上仍需申請豁免使用[14-16]。溴甲烷對農(nóng)田或農(nóng)產(chǎn)品的熏蒸可能會(huì)形成殘留,而溴甲烷無色無味難以引起警戒[17],對人體的肺、腎、肝等臟器及神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)造成潛在危害[18],因此溴甲烷殘留量的檢測和控制尤為重要。

當(dāng)前溴甲烷的檢測方法有離子遷移譜法[19]、酸回流-毛細(xì)管色譜法[20]、吹掃-捕集-氣相色譜法[21]等,這些檢測方法對于茶葉中溴甲烷的檢測不夠便捷,且未使用質(zhì)譜等定性確證工具,尚缺茶葉中溴甲烷檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。溴甲烷是茶葉農(nóng)殘中重點(diǎn)關(guān)注的物質(zhì),英國對茶葉中溴甲烷殘留限量為0.05 mg/kg,我國GB 2763—2021 規(guī)定其臨時(shí)殘留限量為0.02 mg/kg,因此建立茶葉中溴甲烷的便捷、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法至關(guān)重要。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法能夠?qū)ξ粗獦悠分幸讚]發(fā)的物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測,結(jié)合溴甲烷不溶于水、熔點(diǎn)低、易揮發(fā)等理化特性,采用頂空GC-MS 法檢測茶葉中溴甲烷殘留量,能夠?yàn)椴枞~中溴甲烷的檢驗(yàn)和監(jiān)管提供技術(shù)支持,促進(jìn)茶葉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

分析天平：ME203E 型,美國梅特勒-托利多集團(tuán)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2020 型,日本島津公司。

頂空進(jìn)樣器：HS-20型,日本島津公司。

多功能粉碎機(jī)：WJX-A500型,上海緣沃工貿(mào)有限公司。

溴甲烷：色譜純,天津阿爾塔科技有限公司。

甲醇：色譜純,德國默克集團(tuán)。

氯化鈉：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

飽和氯化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取36.00 g 氯化鈉于250 mL燒杯中,加入100 mL去離子水,于磁力攪拌器中常溫?cái)嚢柚寥芙狻?/p>

溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)貯備液：100 μg/mL,準(zhǔn)確稱取0.010 0 g溴甲烷,加入甲醇稀釋至100 mL。

氦氣：體積分?jǐn)?shù)不小于99.999%,福州新航工業(yè)氣體有限公司。

茶葉樣品：分別為白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶,來自福建寧德、福州、泉州和南平四地茶葉產(chǎn)區(qū)。

實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 頂空進(jìn)樣器

轉(zhuǎn)換閥溫度：50 ℃；傳輸線溫度：65 ℃；平衡時(shí)間：30 min。

1.2.2 氣相色譜儀

色譜柱：DB-5MS 石英毛細(xì)管柱[30 m×0.25 mm,0.25 μm,安捷倫科技(中國)有限公司]；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；離子源溫度：300 ℃；接口溫度：300 ℃；柱溫：50 ℃,保持3 min；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣,分流比為100∶1；載氣：氦氣,流量為0.80 mL/min；進(jìn)樣體積：100 μL。

1.2.3 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧離子源(ESI),正離子模式；掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；溴甲烷SIM監(jiān)測離子：m/z94,96（定量離子為m/z94）。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 溴甲烷的提取

參照GB/T 8303—2013,將茶葉樣品研磨粉碎,過30 目篩（孔徑600 μm）,制備成茶粉。分別稱取2.50 g 茶粉于20 mL 頂空瓶中,加入5 mL 的飽和氯化鈉溶液,立即旋蓋密封（瓶蓋中心為聚四氟乙烯薄膜,便于扎入進(jìn)樣針）,置于頂空裝置中,于40 ℃保溫30 min,抽取100 μL上部氣體進(jìn)行GC-MS檢測。

1.3.2 溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取100 μg/mL 溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量,用甲醇分別稀釋至0、2.5、5、10、20、40 μg/mL,制備成系列溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別在含有5.0 mL 飽和氯化鈉溶液的頂空瓶中加入10 μL不同濃度的溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液,于40 ℃保溫30 min,抽取100 μL上部氣體進(jìn)行GC-MS檢測,以溴甲烷質(zhì)量為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 定量方法

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。在1.3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上,將待測茶葉樣品按照1.3.1的方法研磨成粉并經(jīng)過頂空提取之后進(jìn)行GC-MS 檢測,以定量離子m/z94 為SIM 監(jiān)測指標(biāo),將相同保留時(shí)間的目標(biāo)峰的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行溴甲烷質(zhì)量換算。每種待測茶葉樣品平行測定6 次,取平均值作為測定值。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的選擇

氣相色譜柱作為固定相,對同一樣品中的不同物質(zhì)具有不同的吸附和解離能力,其型號對目標(biāo)物質(zhì)的分離度和保留時(shí)間影響較大。溴甲烷的極性較弱,不溶于水而易溶于有機(jī)溶劑,弱極性的DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）對溴甲烷的分離效果優(yōu)于強(qiáng)極性的DB-WAX 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm,0.5 μm）。氣相色譜柱的初始溫度為50 ℃,高于溴甲烷的沸點(diǎn)4 ℃,在該溫度運(yùn)行模式下,溴甲烷的保留時(shí)間為1.65 min,因此無需設(shè)置升溫程序,可按50 ℃恒溫運(yùn)行。對比不同分流比對溴甲烷分離的影響,分流比200∶1時(shí),溴甲烷的響應(yīng)信號較低；分流比為100∶1時(shí),溴甲烷的響應(yīng)信號與分離度均較好；分流比50∶1時(shí),溴甲烷的分離度較差,因此確定最佳分流比為100∶1。

2.2 溴甲烷頂空提取條件優(yōu)化

在進(jìn)行目標(biāo)物的頂空提取時(shí),飽和氯化鈉溶液是常用的提取溶劑,其化學(xué)惰性能夠避免頂空提取過程中的基質(zhì)效應(yīng)[22],還能發(fā)揮鹽析作用改變目標(biāo)物在頂空瓶內(nèi)的分配系數(shù),從而提高檢測靈敏度[23]。分別在茶葉基質(zhì)中添加不同濃度的溴甲烷,比較不同飽和氯化鈉溶液體積對溴甲烷提取的影響,當(dāng)溴甲烷添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.02、0.04、0.20 mg/kg時(shí),分別使用2.5、5.0 mL 飽和氯化鈉溶液進(jìn)行提取,對應(yīng)的色譜峰面積如圖1 所示。結(jié)果表明,較大體積的飽和氯化鈉溶液有助于提高溴甲烷的檢測靈敏度,當(dāng)茶葉基質(zhì)中溴甲烷含量越高時(shí),鹽析作用越明顯,使用5.0 mL的飽和氯化鈉溶液相比于2.5 mL的峰面積差值大,這是由于溴甲烷沸點(diǎn)（4 ℃）低且不溶于水,在頂空瓶體系中易受熱揮發(fā),飽和氯化鈉的鹽析作用降低了溴甲烷在水中的溶解度,當(dāng)飽和氯化鈉體積增加時(shí),進(jìn)一步壓縮了頂空瓶中的氣體體積,從而起到濃縮作用,當(dāng)茶葉基質(zhì)中溴甲烷濃度越高時(shí),其濃縮效果越明顯,儀器檢測的響應(yīng)值越大。因此選定飽和氯化鈉溶液的添加體積為5.0 mL。

圖1 不同飽和氯化鈉溶液的體積對應(yīng)的茶葉基質(zhì)中不同濃度溴甲烷的色譜峰面積

2.3 線性關(guān)系

按照1.3.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得溴甲烷線性方程為y=7.357 3x-18.012,相關(guān)系數(shù)為r=0.999 7,表明線性良好,該GC-MS 檢測方法適用于溴甲烷的檢測。由于不同重復(fù)批次中目標(biāo)物質(zhì)在頂空提取過程中固-液、氣-液的分配比存在微小差異,高濃度樣品的檢測偏差會(huì)被放大,因此當(dāng)樣品中溴甲烷質(zhì)量大于200 ng時(shí),存在一定的檢測偏差,但這種偏差影響較小,依然可以保證溴甲烷測定值的準(zhǔn)確度,故溴甲烷線性范圍確定為0～400 ng。

2.4 方法檢出限和定量限

茶葉樣品基質(zhì)組分復(fù)雜,可能會(huì)對溴甲烷的檢測造成干擾,樣品背景干擾越小,溴甲烷的檢出限和定量限越低。在頂空提取的條件下,茶葉空白基質(zhì)中主要干擾物質(zhì)為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[24],這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有數(shù)十種乃至上百種[25-26],容易對目標(biāo)物造成檢測干擾,而GC-MS 的SIM 監(jiān)測模式可對目標(biāo)質(zhì)荷比（m/z）的離子進(jìn)行監(jiān)測掃描,從而排除其它離子的干擾。分別在2.50 g不同茶葉空白基質(zhì)中添加10 μL 的5 μg/mL 溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液,再加入5.0 mL飽和氯化鈉溶液進(jìn)行頂空提取和GC-MS檢測,由白茶（圖2）、綠茶（圖3）、烏龍茶（圖4）和紅茶（圖5）的空白基質(zhì)及其加標(biāo)樣品的SIM色譜圖可知,不同茶葉空白基質(zhì)對溴甲烷目標(biāo)峰干擾較小,表明該法可用于白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶中溴甲烷的分離檢測。

圖2 白茶空白基質(zhì)（A）與其加標(biāo)樣品（B）的SIM色譜圖

圖3 綠茶空白基質(zhì)（A）與其加標(biāo)樣品（B）的SIM色譜圖

圖4 烏龍茶空白基質(zhì)（A）與其加標(biāo)樣品（B）的SIM色譜圖

圖5 紅茶空白基質(zhì)（A）與其加標(biāo)樣品（B）的SIM色譜圖

分別在2.50 g 不同茶葉空白基質(zhì)中添加10 μL的5 μg/mL 溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液,再加入5.0 mL 飽和氯化鈉溶液進(jìn)行頂空提取和GC-MS 檢測,以溴甲烷目標(biāo)峰的信噪比（S/N）≥3 為檢出限,信噪比（S/N）≥10為定量限。計(jì)算得上述4種茶葉基質(zhì)存在的條件下溴甲烷目標(biāo)峰的信噪比（S/N）分別為13.2、15.2、12.1、15.3,確定該方法的定量限（S/N≥10）為0.02 mg/kg,換算得方法檢出限（S/N≥3）為0.006 mg/kg。GB 2763—2021規(guī)定茶葉中溴甲烷的臨時(shí)殘留限量為0.02 mg/kg,該方法的檢測靈敏度能夠滿足國標(biāo)限量檢測需求。

2.5 方法精密度和準(zhǔn)確度

分別在2.50 g 不同茶葉空白基質(zhì)中添加1.0、2.0、10.0倍定量限（0.02 mg/kg）的溴甲烷標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定體系中溴甲烷的含量并計(jì)算加標(biāo)回收率及變異系數(shù)（CV）,每種樣品每個(gè)加標(biāo)水平平行測定6 次,取平均值作為測定值,結(jié)果見表1。由表1 可知,不同茶葉樣品中溴甲烷的加標(biāo)回收率為91.97%～105.33%,變異系數(shù)不大于10.77%。國標(biāo)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.01～0.1 mg/kg時(shí),回收率應(yīng)為60%～120%,變異系數(shù)要小于21%；目標(biāo)物濃度在0.1～1 mg/kg 時(shí),回收率為80%～110%,變異系數(shù)要小于15%。結(jié)果表明,該方法的回收率和精密度均符合國標(biāo)要求,方法具有可行性。

表1 不同茶葉空白基質(zhì)中溴甲烷加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)語

在優(yōu)化提取方法的基礎(chǔ)上建立了不同茶葉中溴甲烷的頂空GC-MS 檢測法,該法滿足GB/T 27404—2008相關(guān)要求,靈敏度和準(zhǔn)確度高,重現(xiàn)性好,可為茶葉中溴甲烷殘留的檢測和監(jiān)管提供技術(shù)支持,有利于茶葉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。