王文昌，張曉芳，吳娟娟，陳校校，柳慧芳，韓潔

（1.河北晨光檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司,河北邯鄲 057250；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司,河北邯鄲 057250）

7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸殘留的溶劑無治療益處,對(duì)人的健康有潛在的危害[9-10]。依據(jù)藥品審批要求,為了更好地控制頭孢丙烯產(chǎn)品質(zhì)量,必須對(duì)7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸合成過程中所涉及的殘留溶劑進(jìn)行檢測(cè)[11]。國家食品藥品監(jiān)督管理總局在2005年頒布了《化學(xué)藥物殘留溶劑研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》［12］,鼓勵(lì)藥物研發(fā)者嘗試通過多種途徑有效地控制終產(chǎn)品的殘留溶劑。國務(wù)院辦公廳在2016年3 月發(fā)布《關(guān)于促進(jìn)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的指導(dǎo)意見》中提出發(fā)展技術(shù)精、質(zhì)量高的醫(yī)藥中間體、輔料、包材等配套產(chǎn)品。除上述規(guī)定和指導(dǎo)意見外,一些研究人員也參與藥物溶劑殘留的研究,如成海平指出：對(duì)于原料藥來說,合成工藝中使用的有機(jī)溶劑均可能在終產(chǎn)品中殘留[13]。此外,已有相關(guān)研究人員從事于醫(yī)藥中間體的溶劑殘留的質(zhì)量控制研究[14-16]。而在2020 年版《中華人民共和國藥典》（ChP2020）中僅有頭孢丙烯的溶劑殘留量檢測(cè)方法[17],對(duì)7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸沒有要求。因此,需要對(duì)7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸溶劑殘留量進(jìn)行檢測(cè),控制其溶劑殘留量,來保證頭孢丙烯產(chǎn)品的質(zhì)量。

檢測(cè)藥物溶劑殘留量的儀器方法主要有氣相色譜法[18-22]、氣相色譜-質(zhì)譜法[23-24]。作者未查詢到7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸溶劑殘留量檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn)。作者擬采用頂空-氣相色譜法對(duì)7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸中可能存在的丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氫呋喃等溶劑殘留進(jìn)行測(cè)定,建立相應(yīng)的檢測(cè)方法,以期為7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸的質(zhì)量控制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：GC 2030型,配有氫離子火焰檢測(cè)器（FID）,日本島津公司。

頂空進(jìn)樣器：HS-10型,日本島津公司。

電子分析天平,AUY220 型,感量為0.1 mg,日本島津公司。

超聲波清洗器：TH-600 型,濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司。

丙酮：色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

這么晚了，我一個(gè)女孩敢走嗎？以前我走過這兒，嚇?biāo)懒?，心跳得比鼓點(diǎn)還快。萬一車子在這兒拋了錨，那我不死定了？所以我才想找個(gè)在坑梓打工的人做伴。

甲醇：色譜純,德國默克公司。

N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺：色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

二甲基亞砜、四氫呋喃、二氯甲烷：色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

氫氧化鈉：分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸樣品：河北晨光天潤制藥有限公司。

實(shí)驗(yàn)室用水：超純水,電阻率不小于18.2 MΩ·cm。

1.2 色譜條件

色譜柱：HP-FFAP 毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm,0.25 μm,美國安捷倫科技有限公司）；載氣：高純氮?dú)?流量為1.2 mL/min；；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；進(jìn)樣方式：分流模式,分流比為30∶1；柱箱溫度：程序升溫,初始溫度為40 ℃,保持3 min,以3.5 ℃/min速率升到65 ℃,再以20 ℃/min 速率升到220 ℃,保持5 min；檢測(cè)器溫度：235 ℃；氫氣流量：32 mL/min；空氣流量：200 mL/min；尾吹氣流量：24 mL/min；定量環(huán)體積：1 mL；樣品平衡時(shí)間：40.0 min；平衡溫度：80 ℃；流路溫度：100 ℃；樣品傳輸線溫度：105 ℃。

1.3 溶液的配制

丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷的質(zhì)量濃度分別為164.4、169.3、170.5、182.0 mg/mL,分別稱取丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷4 110.0、4 231.9、4 261.9、4 550.0 mg 于25 mL 容量瓶中,使用二甲基亞砜溶解并定容至標(biāo)線,搖勻。

丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷的質(zhì)量濃度分別為16.4、16.9、17.0、18.2 mg/mL,取丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,以二甲基亞砜稀釋并定容至10 mL,搖勻。

丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：分別移取0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2、2.5 mL 丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于25 mL容量瓶中,以二甲基亞砜稀釋并定容,配制成丙 酮 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為67.7、135.4、338.6、677.2、1 015.8、1 354.4、1 693.0 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,甲 醇 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為65.8、131.5、328.8、657.6、986.4、1 315.2、1 644.0 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,四氫呋喃質(zhì)量濃度分別為68.2、136.2、340.8、681.6、1 022.4、1 363.2、1 704.0 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,二氯甲烷質(zhì)量濃度分別為72.8、145.6、364.0、728.0、1 092.0、1 456.0、1 820.0 mg/L 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

氫氧化鈉溶液：0.1 mol/L,使用稱量紙準(zhǔn)確稱取0.4 g 氫氧化鈉,倒入燒杯中,加入適量蒸餾水超聲溶解,攪拌,注入100 mL容量瓶中,冷卻后用水定容至標(biāo)線,搖勻。

樣品溶液：用天平準(zhǔn)確稱取0.1 g 7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸于20 mL 頂空瓶中,使用移液槍加入5 mL的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液,渦旋、超聲溶解,混勻。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確移取丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液0.2 mL于盛有5 mL的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的20 mL 頂空瓶中,在1.2 色譜條件下,按照濃度由低到高順序進(jìn)樣分析,以溶液的質(zhì)量濃度為自變量,所對(duì)應(yīng)的峰面積為因變量進(jìn)行線性回歸,計(jì)算校準(zhǔn)曲線線性方程。取樣品溶液進(jìn)樣分析,以保留時(shí)間定性,以色譜峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱、溶劑和柱溫的選擇

丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氫呋喃均為極性化合物,根據(jù)相似相溶原則,選擇HP-FFAP 毛細(xì)管柱作為色譜柱。

使用氣相色譜法進(jìn)行溶劑殘留測(cè)定時(shí),通常以有機(jī)試劑或水作為溶劑,而7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸不溶于水、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺和二甲基亞砜,試驗(yàn)結(jié)果表明,使用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液作為溶劑,樣品及目標(biāo)物均溶解良好。因?yàn)闅溲趸c溶液與N,N-二甲基甲酰胺反應(yīng),對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生干擾,因此選擇二甲基亞砜作為溶劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制。

丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氫呋喃均為極性溶劑,且沸點(diǎn)較低,沸點(diǎn)分別為57、65、40、66 ℃,根據(jù)氣相初始溫度的設(shè)定原則,將色譜柱的初始溫度設(shè)為40℃。

2.2 專屬性試驗(yàn)

使用移液槍分別量取5 mL 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液于2 只20 mL 頂空瓶中,壓蓋,其中一只加入0.2 mL濃度分別為16.4、16.9、17.0、18.2 mg/mL的丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,渦旋、混勻。以上溶液均按照1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氫呋喃色譜峰的分離度,氣相色譜圖見圖1、圖2。由圖1、圖2 可看出,0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液在溶劑出峰時(shí)間位置無雜峰,對(duì)7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸樣品的測(cè)定不產(chǎn)生干擾；混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液中丙酮、甲醇、二氯甲烷和四氫呋喃化合物全部實(shí)現(xiàn)了基線分離,丙酮和四氫呋喃的分離度為2.1,四氫呋喃和甲醇的分離度為2.7,甲醇和二氯甲烷的分離度為2.3,均大于1.5,滿足中國藥典定量分析測(cè)定要求。

圖1 空白樣品溶液色譜圖

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

分別向盛有5 mL 0.1 mol/L 氫氧化鈉的20 mL頂空瓶中加入0.2 mL丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液,渦旋混勻,按照1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、所對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

按取樣0.1 g溶解稀釋定容至5 mL配制樣品溶液,以10 倍信噪比（S/N）計(jì)算方法的定量限。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限見表1。

表1 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限

2.4 精密度試驗(yàn)

按照1.4實(shí)驗(yàn)方法平行稱取6份7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸樣品于20 mL 頂空瓶中,分別加入5 mL 0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液,并加入0.1 mL丙酮、甲醇、四氫呋喃、二氯甲烷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,壓蓋,得到樣品溶液,按照1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析,計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表2。從表2 可知,4 種溶劑測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.56%,表明本方法的精密度較好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

按照1.4 實(shí)驗(yàn)方法,稱取6 份7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸樣品于20 mL 頂空瓶中,分別進(jìn)行低、中、高三水平加標(biāo)回收試驗(yàn),樣品及加標(biāo)樣品色譜圖如圖3～圖4。樣品加標(biāo)回收率結(jié)果見表3。由表3可知,甲醇、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷回收率為92.53%～109.96%,說明方法的準(zhǔn)確度較高。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

圖3 樣品色譜圖

圖4 樣品加標(biāo)色譜圖

3 結(jié)語

通過對(duì)溶劑、色譜柱等條件的優(yōu)化試驗(yàn),建立了使用0.1%氫氧化鈉溶液溶解7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸樣品,頂空氣相色譜法測(cè)定的方法。所建立的分析方法快速、準(zhǔn)確度高（回收率為92.53%～109.96%）,重復(fù)性好（RSD不大于2.56%）,分離度符合要求,可用于7-氨基-3-(丙烯-1-基)-3-頭孢烯-4-羧酸中甲醇、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷溶劑殘留量的日常檢測(cè)。