郭朝剛

甘肅省天水市麥積區(qū)畜牧獸醫(yī)事務(wù)服務(wù)中心，甘肅天水 741020

0 引言

乳房炎是奶牛較為常見疾病之一。全球?qū)⒔?0%奶?；加腥榉垦?，而我國的發(fā)病率更接近70%，是一種發(fā)病率高且較難預(yù)防和治療的疾病。奶?；加腥榉垦缀?，會(huì)影響乳腺的泌乳功能，導(dǎo)致產(chǎn)奶量降低，乳質(zhì)量降低[1]，如不及時(shí)治療，還會(huì)引發(fā)奶牛全身系統(tǒng)疾病，增加治療周期和治療成本，給牧場(chǎng)造成更多的經(jīng)濟(jì)損失[2]。引起奶牛乳房炎以大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌最為常見，占90%以上。其中大腸桿菌分離率高，入侵奶牛乳房后能迅速產(chǎn)生內(nèi)毒素，且具極強(qiáng)的耐藥性，為乳房炎治療帶來很大挑戰(zhàn)[3]。

甘肅是農(nóng)業(yè)大省，奶牛養(yǎng)殖業(yè)是重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)。甘肅的奶牛養(yǎng)殖業(yè)主要集中在蘭州、天水、平?jīng)觥㈦]南等地，經(jīng)過常年的發(fā)展，正在逐漸改變以往傳統(tǒng)的養(yǎng)殖方式，更加注重科學(xué)、規(guī)范和高效，但奶牛乳房炎仍是困擾發(fā)展的難題，發(fā)病率在25%以上[4]。本研究采集甘肅天水3 個(gè)奶牛場(chǎng)患有臨床乳房炎奶牛乳樣，進(jìn)行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，為當(dāng)?shù)胤揽厝榉垦滋峁﹨⒖肌?/p>

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2022年10—12月選取甘肅天水3 個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)40 頭患有臨床乳房炎的奶牛作為研究對(duì)象，奶牛具體表現(xiàn)為對(duì)乳區(qū)觸碰反應(yīng)敏感，乳房紅腫、發(fā)熱及乳汁中有血絲和凝塊現(xiàn)象。共120 份奶牛乳房炎乳樣，每頭牛各乳區(qū)的乳樣均作為獨(dú)立樣本，不可混采。

1.2 主要試劑及儀器

CAMHBT營養(yǎng)肉湯、MH培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基、水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、血瓊脂平板、革蘭氏染液、LB肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏陰性菌鑒定板、革蘭氏陰性菌藥敏板，美國賽默飛公司；恩諾沙星、氨芐西林、阿莫西林、頭孢唑啉、氧氟沙星、頭孢噻呋、慶大霉素、環(huán)丙沙星、阿奇霉素、氟苯尼考、甲砜霉素、多西環(huán)素、土霉素、頭孢氨芐、四環(huán)素、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺異唑等抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀、恒溫培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋，嘉興中新醫(yī)療儀器有限公司；超凈臺(tái)，美國賽默飛公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品采集

對(duì)奶牛乳區(qū)消毒后，棄去頭3 把奶，每個(gè)乳區(qū)收集10 mL乳樣，置于無菌離心管中于4 ℃保溫盒中，送至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

2.2 病原菌的分離和鑒定

采集2 mL乳樣分別涂抹接種在甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基、血瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，選擇有特定顏色、形狀、光澤的菌落。其中，甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基中選擇金黃色、圓形菌落；血瓊脂平板中選擇具有溶血環(huán)、圓形、暗金屬光澤的小菌落；麥康凱培養(yǎng)基中選取圓形、紅色金屬光澤菌落；SS培養(yǎng)基中選取圓形、黑色金屬光澤菌落。

將4 種培養(yǎng)基中選取的菌落用平板劃線法增殖培養(yǎng)，純化后進(jìn)行將菌液加入梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀中進(jìn)行細(xì)菌鑒定[5]。

2.3 體外藥物敏感試驗(yàn)

2.3.1 菌液制備

使用接種環(huán)在LB肉湯培養(yǎng)基中挑選復(fù)活的大腸桿菌樣本，并在37 ℃環(huán)境中進(jìn)行6～8 h復(fù)蘇培養(yǎng)。為確保單菌落活性，在血瓊脂平板上繼續(xù)進(jìn)行37 ℃的6～8 h培養(yǎng)。經(jīng)過鏡檢后，使用無菌棉簽將菌落提取并置入水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋，使其達(dá)到1.5×108CFU/mL，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 藥敏試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[6]。從高壓滅菌的棉簽中獲取菌液濃度為1.5×108CFU/mL的大腸桿菌菌液。在經(jīng)過滅菌的空心管中通過擠壓去除多余菌液，然后輕輕涂抹到MH培養(yǎng)基的表面上。將平皿置于超純工作臺(tái)中靜止2～3 min，使表面菌液變干。用經(jīng)過滅菌的鑷子將藥敏紙片輕輕壓實(shí)到平皿表面上。每個(gè)平皿上放置5 種不同藥敏紙片，每個(gè)菌株3 個(gè)平行樣本。將平皿置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。最后用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑并記錄結(jié)果。按照美國臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，大腸桿菌對(duì)各種藥物的耐藥性及敏感性都根據(jù)紙片抑菌圈直徑判定，標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，分別有耐藥、中介和敏感3 個(gè)等級(jí)。此外，藥敏試驗(yàn)出現(xiàn)耐藥或中介2 個(gè)等級(jí)均可判斷大腸桿菌耐藥。

表2 乳房炎病原菌分離、鑒定結(jié)果

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 病原菌分離、鑒定結(jié)果

成功分離出140 個(gè)菌株，9 種不同的病原菌（表2）。大腸桿菌45 株，產(chǎn)氣腸桿菌2 株，金黃色葡萄球菌38 株，表皮葡萄球菌8 株，腐生葡萄球菌4 株，無乳鏈球菌20 株，乳房鏈球菌12 株，停乳鏈球菌10株、沙門氏菌1 株。其中，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的數(shù)量最多，分別占32.1%、27.1%和14.3%。

3.2 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法測(cè)定不同抗菌藥物對(duì)大腸桿菌的影響程度（表3）。45 株大腸桿菌受試菌株中有45 株對(duì)青霉素耐藥，耐藥率高達(dá)100%，而大腸桿菌對(duì)萬古霉素的敏感性最高，45株菌株中未檢測(cè)到耐藥性。此外，氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素對(duì)大腸桿菌敏感率均為95.6%；卡那霉素對(duì)大腸桿菌敏感率為86.7%；氨芐西林和四環(huán)素對(duì)大腸桿菌敏感率為55.6%；紅霉素對(duì)大腸桿菌敏感率為44.4%。

表3 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 分析與討論

4.1 奶牛乳房炎病原菌分離鑒定

奶牛乳房炎一般為多種病原菌混合感染導(dǎo)致，常見主要有20 多種。病原菌分離常見的有培養(yǎng)基分離法、抗生素敏感法及菌落膜法，其中培養(yǎng)基分離法和抗生素敏感法較常用。

本試驗(yàn)采用培養(yǎng)基分離法。其基于生物學(xué)培養(yǎng)原理，即每種病原菌在不同培養(yǎng)基中生長情況不同，具有特定顏色、形狀、光澤，因此通過對(duì)不同培養(yǎng)基中菌落進(jìn)行選擇可分離出不同菌株，該方法易實(shí)現(xiàn)，不需復(fù)雜技術(shù)，且通過對(duì)不同培養(yǎng)基進(jìn)行分離可獲得較多菌株，從而提高分離效率。但需指出的是，該方法不能保證分離出所有病原菌，會(huì)有遺漏，且對(duì)病原菌判定只基于菌落外觀特征，而不是通過其生物學(xué)特性或基因組等信息，因此還需進(jìn)一步鑒定。

對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定的方法有生化反應(yīng)鑒定、染色鑒定、生物學(xué)鑒定等。染色鑒定通常使用各種染色液，對(duì)分離出的病原菌進(jìn)行染色，觀察菌絲形狀、顏色、結(jié)構(gòu)等特征以確定病原菌種類，這種方法簡便易行，不需高技術(shù)人員，但染色效果不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)誤診。生物學(xué)鑒定通常使用生物學(xué)試劑盒，對(duì)分離出的病原菌進(jìn)行生物學(xué)試驗(yàn)，如酶活性試驗(yàn)、吸納試驗(yàn)等，以確定病原菌種類，這種方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，但復(fù)雜、耗時(shí)。本試驗(yàn)使用生化反應(yīng)鑒定，即使用梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，對(duì)分離出的病原菌進(jìn)行生化反應(yīng)，如代謝特征、酶特征、吸納特征等，以確定病原菌種類，這種方法簡便、快速，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。

據(jù)研究，不同地區(qū)引起奶牛乳房炎的病原菌種類及比例都有區(qū)別。新疆地區(qū)大腸桿菌的檢出率最高，占20.9%，而無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的檢出率分別為14.6%和14.5%；吉林地區(qū)大腸桿菌的檢出率最高，為34.5%，其次為無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，檢出率分別為23.0%和11.8%[7]。各地區(qū)結(jié)果不一致的主要原因是地理環(huán)境、氣候不同，而同一地區(qū)奶牛場(chǎng)由于衛(wèi)生環(huán)境、飼養(yǎng)技術(shù)、管理規(guī)范制度不同也可能導(dǎo)致病原菌種類出現(xiàn)差異。

4.2 大腸桿菌藥敏試驗(yàn)

大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。目前針對(duì)奶牛乳房炎的臨床用藥主要有：青霉素類、四環(huán)素類、頭孢菌素類以及磺胺類。近年由于缺乏合理用藥意識(shí)，盲目使用及隨意加大劑量使用，導(dǎo)致耐藥菌越來越多，耐藥譜越來越寬，為臨床中奶牛乳房炎治療增添更多困難。研究報(bào)道，在新疆地區(qū)奶牛乳房炎中大腸桿菌對(duì)青霉素和紅霉素的耐藥率較高，分別為95.2%和90.5%，使這兩種藥幾乎無效；遼寧地區(qū)奶牛中大腸桿菌對(duì)青霉素嚴(yán)重耐藥，耐藥率高達(dá)99.2%，對(duì)紅霉素、四環(huán)素和氨芐西林的耐藥率相對(duì)較高，在47%～90%[8]。綜上研究可發(fā)現(xiàn)，由于日常用藥習(xí)慣，不論什么地區(qū)，常用藥物如青霉素，紅霉素，四環(huán)素的效果越來越差。本試驗(yàn)?zāi)退幮越Y(jié)果與其他地區(qū)結(jié)果相接近，大腸桿菌對(duì)青霉素耐藥率較高；四環(huán)素、紅霉素和氨芐西林的耐藥率在22.2%左右，而萬古霉素的耐藥性幾乎沒有。分析原因是青霉素、紅霉素、四環(huán)素知名度高且相對(duì)便宜，各大奶牛場(chǎng)都選擇這類藥物進(jìn)行乳房炎治療，而萬古霉素一方面是成本更高，另外雖然抗菌譜更廣，可治療更多種細(xì)菌感染，但副作用相對(duì)更嚴(yán)重，因此實(shí)際應(yīng)用中會(huì)更謹(jǐn)慎選擇萬古霉素和卡那霉素治療常見奶牛乳房炎疾病。

最后應(yīng)當(dāng)指出的是，不同地區(qū)奶牛場(chǎng)的奶牛，對(duì)不同抗菌藥物的耐藥性差別影響到實(shí)際藥物療效。Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法主要測(cè)定大腸桿菌等細(xì)菌的耐藥性，其原理是在特定培養(yǎng)基上涂抹大腸桿菌樣本，再在上面放置抗生素紙片，最后觀察細(xì)菌生長情況，以此判斷細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性。該方法簡單易行無需復(fù)雜設(shè)備，成本較低且能快速準(zhǔn)確測(cè)定大腸桿菌的耐藥性，適合各大奶牛場(chǎng)在選擇藥物前進(jìn)行簡單的藥敏試驗(yàn)診斷，并根據(jù)結(jié)果選擇最合適的抗菌藥物，制定合理用藥方案。