賀泂杰

中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730050

0 引言

牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea，BVD）是世界范圍內(nèi)最重要的牛畜疾病之一，不但損害動物福利，而且給牛肉產(chǎn)業(yè)和乳制品工業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。BVD是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起，是單鏈RNA病毒，大小約為12.3 kb，屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的代表種。這個屬的成員中還包括羊邊界病毒（BDV）和豬瘟病毒（CSFV）[2]。

根據(jù)臨床表現(xiàn)將BVD分為急性和慢性兩種。急性型病例常突然發(fā)病，癥狀為厭食，鼻、眼流出漿液性鼻漏，咳嗽，呼吸急促，流涎，精神委頓，體溫達40 ℃，同時伴隨白細胞減少。隨著病情的發(fā)展，病牛鼻鏡糜爛，表皮脫落，舌面上皮壞死，流涎增多，呼氣惡臭，并且發(fā)生嚴重腹瀉，犢牛死亡率高于高日齡的牛。部分病?？沙霈F(xiàn)蹄葉炎和趾間皮膚壞死糜爛，進而導致其跛行。成母牛病情嚴重程度不同，但其泌乳量會顯著減少，甚至停止泌乳。慢性病例的病?？沙霈F(xiàn)明顯的發(fā)熱癥狀，但體溫高于正常波動，病牛鼻鏡糜爛連成一片，病牛眼角有漿液性分泌物，病?？谇挥猩倭棵訝€，但齒齦通常發(fā)紅。多數(shù)病例常出現(xiàn)跛行。大多數(shù)病例在患病2～6 個月后死亡，但也有部分病例病程在1 年以上。妊娠母牛感染BVDV常出現(xiàn)流產(chǎn)，或產(chǎn)下先天性免疫缺陷的犢牛，或是小腦發(fā)育不全。在妊娠后期感染BVDV，母牛還可產(chǎn)下免疫耐受的持續(xù)性感染的病牛，不表現(xiàn)臨床癥狀，但免疫水平低下，并可持續(xù)向牛群中釋放病毒，成為該病重要的傳染源[3]。

PCR檢測被認為是BVDV臨床診斷的“金標準”[4]，多重PCR、實時PCR和巢式PCR由于其高靈敏度、特異性、時效性和可重復性，已廣泛應(yīng)用于BVDV檢測[5]。但這些方法有一些固有缺點，如需要昂貴的設(shè)備和對擴增樣品進行后續(xù)操作等，限制了它們的使用范圍[6]。

交叉引物擴增（Cross-priming Amplification，CPA）是一種新型的等溫擴增技術(shù)，可與核酸試紙條帶結(jié)合用于BVDV感染的快速檢測鑒定，是克服上述缺陷的一種替代工具[7]。CPA還允許擴增在沒有任何儀器輔助的情況下實現(xiàn)肉眼可視化，是許多動植物病原體（細菌、病毒等）的有效診斷技術(shù)[8]。本文利用CPA檢測方法，以5'UTR基因為靶點，特異性檢測BVDV的mRNA，利用野外和試驗感染的樣本評估CPA檢測的臨床性能，并與傳統(tǒng)PCR進行檢測效率的比較。

1 材料與方法

1.1 糞便樣本

2022年8月，對甘肅省某牧場100 份出現(xiàn)腹瀉癥狀的犢牛進行抗生素治療但無效，對犢牛腹瀉糞便樣本進行細菌檢測，均呈現(xiàn)陰性。因此，又進行病毒檢測，結(jié)果為BVDV感染。樣本在-80 ℃下儲存，待用。

1.2 主要試驗材料和試劑

腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）、大腸埃希菌（Escherichia coli）和彎曲桿菌（Campylobacter）來自于中國廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；牛冠狀病毒（Bovine Coronavirus，BCoV）、牛病毒性腹瀉病毒、牛輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV）由本實驗室分離鑒定。

BstDNA聚合酶、10×TermopolReactionBufer、dNTPs和MgSO4，Takara公司；甜菜堿，美國Sigma公司；一次性核酸檢測試紙，杭州優(yōu)斯達公司；DNA提取試劑盒、凝膠提取試劑盒、質(zhì)粒Mini試劑盒，美國OMEGA公司；GoldView染料，索萊寶科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計

選擇5'UTR基因作為靶基因設(shè)計CPA檢測引物和探針。利用PRIMER5.0軟件設(shè)計一組CPA引物，分析雙相形成、發(fā)夾形成和引物二聚體。引物包括兩個置換引物（5s和4a）、一個交叉引物2s1a和兩個檢測引物2s和3s。檢測引物2s在5'端標記生物素，3s在5'端標記異硫氰酸熒光素（FITC）。該交叉引物由5'端2s和3'端1a組成。引物見表1。

表1 CPA引物和探針序列

1.4 BVDV-CPA反應(yīng)體系建立

BVDV-CPA反應(yīng)體系如表2。BVDV-CPA反應(yīng)管60 ℃孵育60 min，80 ℃孵育2 min終止反應(yīng)。檢測CPA擴增時，將每種CPA產(chǎn)物5 μL與95 μL磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）混合。

表2 BVDV-CPA反應(yīng)體系

1.5 BVDV-CPA反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的優(yōu)化

將一次性核酸檢測試紙放入稀釋后的樣品中，室溫孵育2 min。同時顯示檢測線和控制線時，反應(yīng)被認為是陽性，而僅顯示控制線時，反應(yīng)被認為是陰性。在56～66 ℃不同溫度和20～120 min不同時間下檢測，確定BVDV引物的最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間。隨后用一次性核酸檢測試紙檢測擴增產(chǎn)物。

1.6 BVDV-CPA靈敏性和特異性

為評價BVDV-CPA 檢測方法的靈敏度和檢出限度，本試驗以RNase-free water為稀釋液，將BVDV病毒RNA在0.025 6～2 000 pg/μL范圍內(nèi)稀釋5 倍。8 種稀釋度分別為2 000 pg/μL、400 pg/μL、80 pg/μL、16 pg/μL、3.2 pg/μL、0.64 pg/μL、0.128 pg/μL、0.025 6 pg/μL。

為評估特異性，采用CPA方法對BVDV RNA和其他引起牛腹瀉的病原體[沙門氏菌腸炎（Salmonella Enteritidis）、大腸埃希菌（Escherichiacoli）、彎曲桿菌（Campylobacter）、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒]進行特異性評估。所有結(jié)果均采用一次性核酸檢測試紙，進行重復獨立試驗。

1.7 使用現(xiàn)場采集樣本評估CPA檢測準確率

采用PCR和基因測序再次確認所檢測樣本均為陽性樣本。使用CPA和PCR檢測現(xiàn)場采集的100 份陽性樣本，將CPA結(jié)果與PCR結(jié)果比較，評估CPA檢測的準確性。PCR反應(yīng)體系如表3。PCR條件為：95 ℃一步初始變性3 min；35 個循環(huán)變性在95 ℃30 s，55 ℃30s，72 ℃延伸1min；最后一步在72 ℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物在含有GoldView染料的1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并在紫外線下檢測。

表3 PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 最佳擴增溫度和時間

最佳CPA擴增溫度在56～66 ℃的范圍內(nèi)確定。結(jié)果顯示，在62 ℃和64 ℃時，CPA擴增效果良好。因此，選擇62 ℃作為最佳擴增溫度，用于后續(xù)的CPA反應(yīng)（圖1）。然后確定CPA擴增在62 ℃下后，時間20～120 min的范圍內(nèi)確定。結(jié)果顯示，孵育20 min后出現(xiàn)一條弱線，60 min后觀察到該線顏色最為顯著（圖2）。

圖1 BVDV-CPA反應(yīng)溫度的優(yōu)化

圖2 BVDV-CPA反應(yīng)時間優(yōu)化

2.2 BVDV-CPA具有檢測特異性

選擇BVDV5'UTR基因作為目標序列設(shè)計CPA引物和探針。BVDV-CPA檢測中使用引物和探針的特異性通過BVDV和其他引起犢牛腹瀉的病原體：基因組進行評估，在62 ℃下擴增60 min后，只有BVDV的基因組呈陽性結(jié)果，這表明BVDV與其他病原體樣本沒有交叉反應(yīng)（圖3）。

圖3 CPA-BVDV方法的特異性分析

2.3 BVDV-CPA的檢測閾值

對RNA進行5 倍連續(xù)稀釋，每次反應(yīng)范圍為2 ng～25.6 fg，重復進行評估。結(jié)果表明，CPA法靈敏度高，檢出限為640 fg（圖4）。

圖4 BVDV-CPA檢測限度

2.4 BVDV-CPA的陽性檢出率

利用100 份現(xiàn)場陽性糞便樣本，評估BVDV-CPA檢測的性能。結(jié)果表明，BVDV-CPA陽性檢出率88%，PCR陽性檢出率為65%（表4）。因此，本研究建立的CPA方法比PCR檢測法具有更高的準確性。

表4 BVDV-CPA與PCR的準確率對比

3 討論

造成牛腹瀉的因素很多，如飼料、畜舍條件等環(huán)境因素[9]以及細菌、寄生蟲、病毒等引起的感染等[10]。后者常常造成該病的診斷難度較大，如不能準確確定致病因素，對癥下藥，會造成病情加重，甚至導致病牛死亡。因此診斷環(huán)節(jié)是防治BVD的關(guān)鍵[11]。本文建立一種檢測BVDV感染的CPA方法。與PCR相比，該診斷技術(shù)不需要復雜設(shè)備，具有簡單讀出系統(tǒng)，易于操作，可用于診斷偏遠或資源有限地區(qū)的BVDV檢測。

在過去十年中，研究人員為簡化病原體檢測做出巨大努力。一些新技術(shù)和設(shè)備已被開發(fā)用于病原體檢測。加快“樣品-結(jié)果-輸出”的疾病檢測[12]，這可能為將來疾病診斷技術(shù)發(fā)展提供啟示。其中CPA已被證明在檢測人類、動物和植物病原體方面有效[13]，具高特異性和可視化優(yōu)點，為核酸快速診斷提供便利，具有潛在的應(yīng)用前景[14]。本研究設(shè)計引物，并建立一種CPA方法，針對BVDV 5'UTR基因，將CPA反應(yīng)與逆轉(zhuǎn)錄結(jié)合，在恒溫條件下擴增BVDV的RNA，在62 ℃下，用制備好的模板在60 min完成。產(chǎn)生的擴增子與核酸檢測試紙結(jié)合時，使檢測更容易。CPA檢測BVDV的方法具很高特異性，并且在檢測BVDV感染的臨床樣品中被證明有效，陽性檢出率高。CPA檢測在BVDV的現(xiàn)場監(jiān)測中具有良好潛力。同時選擇的BVDV 5'UTR基因保守序列是BVDV1型和2型中的共有序列，因此可以同時檢測出BVDV1型和BVDV2型，但不能區(qū)分這兩種類型病毒。

在開發(fā)成功的CPA檢測方法過程中，引物設(shè)計至關(guān)重要。為準確檢測，引物在確保特異性和敏感性方面起至關(guān)重要作用，其設(shè)計是CPA的難點之一。由于CPA檢測使用5 個引物來識別目標DNA序列上5 個不同區(qū)域，這使CPA檢測比用2 個引物的傳統(tǒng)PCR更具特異性。同一管中存在多個引物可導致非特異性擴增，導致假陽性和誤導性檢測結(jié)果[15]。在確定最終BVDV 5'UTR CPA引物前，做了大量前期試驗，篩選多套引物，以剔除給出非特異性擴增產(chǎn)物的引物。

4 小結(jié)

快速檢測技術(shù)BVDV-CPA操作方便，特異性強，靈敏度高，不需要復雜的試驗設(shè)備，適用于戶外和基層醫(yī)療單位的分析，是一種理想的快速檢測BVDV 的系統(tǒng)，在監(jiān)測病毒性疾病方面具有很大潛力。