張紅梅，袁溶英，王 峰，薛海龍，姬 陽

榆林市畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，陜西榆林 719000

0 引言

牛病毒性腹瀉（Bovine Viral Diarrhea Disease，BVD）又稱為牛病毒性腹瀉/黏膜病，是由牛病毒性腹瀉病毒 （Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）感染牛、山羊、綿羊、鹿等多種動物而引起的直接或者間接接觸性傳染病，可造成呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)機(jī)能發(fā)病，且引起感染動物免疫抑制，誘發(fā)其他病原微生物混合或繼發(fā)感染[1]。奶牛感染BVDV后可以潛伏帶毒和持續(xù)性排毒，通過污染糞便、料草等多種途徑傳播病毒，是主要的病毒傳染源。妊娠母?？赏ㄟ^胎盤垂直傳播胎兒，尤其在妊娠初期的120 d內(nèi)病毒可穿透胎盤而感染胎兒，此外病毒也可通過精液傳播[2，3]。每個生產(chǎn)階段奶牛均可感染，特別是犢牛最易感染，不同生產(chǎn)階段表現(xiàn)出多樣化的臨床癥狀，常以嚴(yán)重腹瀉為主，發(fā)病急，潛伏期在24 h內(nèi)，發(fā)病率通常不高，約為5%，但病死率為90%～100%[4]。妊娠奶牛感染后呼吸困難，體溫升高，間歇性腹瀉，體況消瘦，有時發(fā)生流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙。

BVD于1946年由Olafsan首次在美國紐約州奶牛中檢測到，分布世界各地[5]。我國最早在1980年發(fā)現(xiàn)BVDV，由于奶牛規(guī)模養(yǎng)殖發(fā)展，管理水平參差不齊，BVD在我國多地均有不同程度流行，并有不斷擴(kuò)大的趨勢[6]，嚴(yán)重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，已成為當(dāng)前我國奶牛疫病防控中主要的傳染病之一。目前，榆林市奶牛場BVD流行情況還未見報道。本研究選取5 家奶牛場，采用雙抗體夾心ELISA方法檢測BVDV血清抗體，以期掌握該病在榆林市奶牛養(yǎng)殖業(yè)流行特點，為制定有效技術(shù)防控方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2022年4—12月在榆林市選擇5 家未免疫BVDV疫苗的奶牛場，采集全血156 份，其中犢牛（0～6月齡）45 份，育成牛（7～18 月齡）58 份，成母牛53 份。室溫靜置自然凝固10～20 min，常規(guī)方法離心收集血清，編號，-20 ℃保存?zhèn)錂z。

1.2 主要試劑和儀器

BVDV抗原ELISA檢測試劑盒（特異性和敏感性均為99.9%），溫州科淼生物科技有限公司；SPR-960酶標(biāo)儀（450 nm波長濾光片），美國Bio-Rad公司；微量振蕩器、恒溫箱，上海普林斯頓公司。

1.3 檢測方法

按照BVDV抗原ELISA檢測試劑盒說明書操作，具體檢測步驟為：（1）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：在酶標(biāo)包被板設(shè)置10 個標(biāo)準(zhǔn)孔，各取100 μL標(biāo)準(zhǔn)品分別加入第1、2孔，然后分別加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，混勻，再從第1、2孔各取100 μL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品依次加入第3、4孔，并分別加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，按照此方法依次類推，直到第9、10孔（最后第9、10孔各取50 μL棄掉）。（2）加樣：在待測樣品孔中先加40 μL樣品稀釋液，然后加入10 μL待測樣品，混勻。同時設(shè)陰性對照孔、陽性對照孔各2 個，空白孔1 個。在陰性對照孔、陽性對照孔分別加入陰性對照、陽性對照50 μL。（3）溫育：用封板膜封板后置37 ℃恒溫箱溫育30 min。（4）洗滌：揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿配制后的洗滌液（20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋），靜置后棄去液體，重復(fù)5 次，拍干。（5）加酶：除空白孔外，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL。（6）溫育、洗滌：分別同上述（3）（4）步驟。（7）顯色：每孔加入顯色劑A、B各50 μL，混勻，37 ℃避光顯色10～30 min。（8）終止：每孔加終止液50 μL。（9）測定：以空白孔調(diào)零，加終止液后15 min內(nèi)在波長450 nm處測量各孔的吸光度值（OD450）。（10）結(jié)果判定：當(dāng)陽性對照孔OD450平均值≥1.00，陰性對照孔OD450平均值≤0.10時試驗成立。臨界值（CUT OFF）＝陰性對照孔OD450平均值＋0.15。待測樣品OD450值＜CUT OFF者判為陰性；待測樣品OD450值≥CUT OFF者判為陽性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 不同奶牛場的BVDV抗原檢測

對5 家奶牛場156 份血清樣品采用雙抗夾心ELISA方法檢測BVDV血清抗原，結(jié)果顯示，BVDV抗原平均陽性率為4.49%（7/156）。5 家奶牛場BVDV抗原陽性率介于0～6.38%，其中，E奶牛場BVDV抗原陽性率最高，為6.38%，D奶牛場有效率最低，為0（表1）。

表1 不同奶牛場的BVDV抗原檢測結(jié)果

2.2 不同年齡階段奶牛的BVDV抗原檢測

采用雙抗夾心ELISA方法對不同年齡階段奶牛血清樣品進(jìn)行BVDV抗原檢測，結(jié)果顯示，成母牛、犢牛、育成牛BVDV抗原陽性率分別為5.66%、4.44%、3.45%（表2）。

表2 不同年齡奶牛的BVDV抗原檢測

3 討論

ELISA檢測原理是以體外抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，將酶的高效催化作用與抗原抗體特異性反應(yīng)相結(jié)合的一種檢測方法，主要有雙抗夾心法、間接法、直接法和競爭法，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)試驗、生物制藥、疫病流行病學(xué)調(diào)查等方面。本試驗采用雙抗體夾心法，具有靈敏度高、操作簡單、檢測速度快等特點，可用于大批量樣本檢測。

據(jù)報道，中國奶牛中合并BVDV流行率約為53.0%[7]。目前，我國奶牛場以規(guī)?；B(yǎng)殖為主，盡管精細(xì)化管理能夠降低BVDV感染率，但由于地區(qū)間氣候環(huán)境差異，飼養(yǎng)密度較大，飼養(yǎng)管理和疫病防控能力不強(qiáng)，部分地區(qū)奶牛場依然存在BVDV感染高風(fēng)險。王麗屏等[6]對云南省4 個州部分奶牛場456 份血清樣品進(jìn)行BVDV抗原檢測，抗原陽性率為0.53%。魏其等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆部分地區(qū)牛養(yǎng)殖場BVDV陽性檢出率為22.5%～62.5%，平均總陽性率為40.0%。何小麗等[9]報道，寧夏奶牛場BVDV抗原陽性率最高為5.0%，平均陽性率為1.48%。楊德新等[10]對河南省奶牛場BVD流行病學(xué)調(diào)查，5 486 份血清BVDV抗原陽性率為1.77%。結(jié)合本次調(diào)查成母牛、犢牛、育成牛BVDV抗原陽性情況分析，成母牛陽性率最高（5.66%），其次為犢牛（4.44%）、育成牛（3.45%），犢牛和育成牛差異不大，除與本次調(diào)查抽樣數(shù)量少有關(guān)外，也與成母牛生長周期長，感染BVDV風(fēng)險高，其抗原陽性率高于犢牛和育成牛，或者成母牛是在懷孕期間感染BVDV，導(dǎo)致該病毒在幼牛體內(nèi)建立免疫耐受或者持續(xù)性感染有關(guān)[11]。

4 防控方法

BVD流行廣泛，致病機(jī)理復(fù)雜，目前還缺乏有效的治療藥物。牛病毒性腹瀉是一種以水平傳播為主的疾病，由于病毒特性，一旦奶牛場發(fā)生BVD流行，很難徹底根除，淘汰攜帶病毒的動物成為防控該病的重要方法[12，13]。凈化根除BVD，需要對奶牛場采取加強(qiáng)引種檢疫、生物安全措施、免疫接種、定期檢測等綜合防控措施。

4.1 引種檢疫

禁止從疫區(qū)引種。奶牛場在引種前需要對引進(jìn)奶牛進(jìn)行BVDV血清抗原和核酸檢測，重點對持續(xù)性感染牛檢疫，發(fā)現(xiàn)染疫奶牛采取隔離、撲殺等方法，防止BVD傳播。

4.2 生物安全措施

嚴(yán)格落實環(huán)境消毒、衛(wèi)生防疫制度，及時徹底清理分泌物和排泄物，保持圈舍通風(fēng)、干燥、清潔。

4.3 定期檢測

持續(xù)感染奶牛的淘汰是規(guī)模化奶牛場防控BVD最好的方式，也是規(guī)?；膛鲎罱?jīng)濟(jì)的做法。每年定期開展BVD血清學(xué)調(diào)查，全面檢測BVDV血清抗體和抗原，了解流行情況。懷孕早期病毒穿過胎盤，可導(dǎo)致持續(xù)感染犢牛的出生。持續(xù)感染的奶牛通常比短暫或急性感染的奶牛能更有效地傳播BVDV，因為能夠在其一生中排出大量的病毒，并且被認(rèn)為是BVDV的主要儲存庫[14]，因此要重點關(guān)注、及時篩查和清除持續(xù)感染BVDV奶牛。對檢測的陽性奶牛隔離，30 d后再采血檢測，淘汰仍為陽性者，并跟蹤檢測其母代奶牛。

4.4 免疫接種

疫苗有弱毒苗和滅活苗，育成牛在配種前再接種弱毒疫苗1 次，免疫期為1 年。若應(yīng)用滅活疫苗，母牛配種前可免疫接種2 次，可有效預(yù)防該病。妊娠母牛在產(chǎn)前注射豬瘟兔化弱毒疫苗，15 份/頭，也可以有效預(yù)防本病感染[15]。對BVDV抗原陰性奶牛及時進(jìn)行BVDV疫苗免疫接種。

5 結(jié)論

本次流行病學(xué)調(diào)查初步摸清了榆林市奶牛場BVD流行特點。結(jié)果顯示，在5 家奶牛場采集的156 份血清中檢測到7 份BVDV抗原陽性，陽性率為4.49%，成年母牛陽性率較高，表明榆林市奶牛場BVD流行比較廣泛。建議采取檢疫檢測、淘汰陽性牛和持續(xù)性感染牛，生物安全措施與免疫接種等多種防控方法。