王明明，彭雪琦，葛曉曉，莊件兵，張維祥

（江蘇省生產(chǎn)力促進(jìn)中心，江蘇 南京 210000）

0 引言

從2018 年7 月開始，F(xiàn)DA 宣布召回纈沙坦，因?yàn)檫@種藥物中含有N-亞硝基二甲胺（NDMA）。對(duì)所有制造商的血管緊張素受體阻滯劑（ARB）類活性藥物成分（API）和成品藥的后續(xù)調(diào)查也導(dǎo)致了纈沙坦、厄貝沙坦和氯沙坦被額外召回。已發(fā)現(xiàn)這些藥品中含有NDMA 和N-亞硝基二乙胺（NDEA），兩者均為已知?jiǎng)游镏掳┪锖鸵伤迫祟愔掳┪?。隨后，N-亞硝基異丙胺（NEIPA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）和N-亞硝基甲基-4-氨基丁酸（NMBA）等其他雜質(zhì)均被標(biāo)記為潛在的亞硝胺雜質(zhì)。迄今為止，1 100 多個(gè)不同批次的沙坦類藥物（纈沙坦、氯沙坦和厄貝沙坦）已被召回，因?yàn)槠渲兴倪@些雜質(zhì)已超過了臨時(shí)限值[1]。

1 亞硝胺類雜質(zhì)的來源

在藥品的生產(chǎn)過程中，在特定工藝條件下，使用到某些起始物料、原料和中間體，在API 生產(chǎn)過程中可能會(huì)形成亞硝胺雜質(zhì)。這些亞硝胺雜質(zhì)在后續(xù)的API 生產(chǎn)工藝步驟中可能無法全部清除。

胺類物質(zhì)和亞硝酸鹽的反應(yīng)。使用亞硝酸鈉（NaNO2），或其他亞硝酸鹽，當(dāng)存在仲胺或叔胺時(shí)，可能會(huì)形成亞硝胺物質(zhì)。仲胺可能會(huì)在試劑和溶劑中以雜質(zhì)或降解物出現(xiàn)。它們可能是試劑、溶劑、API、其降解產(chǎn)物和前體結(jié)構(gòu)的一部分[2]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；Agilent7890B-7000D 氣質(zhì)聯(lián)用儀，安捷倫；聚乙二醇石英毛細(xì)管柱HP-INNOWAX，色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；旋渦混勻儀WH-3，上海滬西分析儀器廠有限公司；分析天平，BSA224S-CW，賽多利斯；飛鴿牌臺(tái)式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；超純水，色譜純乙腈，Honeywell 公司；色譜純甲醇，Honeywell 公司；N-亞硝基二乙胺（NDEA）標(biāo)準(zhǔn)品，100μg/mL，DR 公司；N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIA）標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，ANPEL 公司；奧美沙坦酯片，20 mg/片，北京福元醫(yī)藥公司。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件

毛細(xì)管柱：HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm，0.25 μm；檢測(cè)器：安捷倫7000D；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測(cè)器溫度：280 ℃；模式：不分流；恒流模式，流量：1 mL/min；載氣：He；進(jìn)樣量：2 μL；柱箱溫度：起始溫度40 ℃，維持0.5 min，再以20 ℃/min 的速率升溫至200 ℃，再以60 ℃/min 的速率升溫至250 ℃，維持15 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊（EI）離子源；電離電壓70 eV；離子源溫度280 ℃；四極桿溫度Q1和Q2為150 ℃。采用選擇離子監(jiān)測(cè)模式定量分析；碰撞氣體流速：氮?dú)猓?.5 mL/min；猝滅氣體流速：氦氣，4 mL/min 溶劑延遲3 min。

3 種亞硝胺類物質(zhì)特征離子參數(shù)為N-亞硝基二乙 胺（NDEA）（102，85，56）、N-亞硝基二甲胺（NDMA）（74，44，42）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）（130，88，42）。

2.3 樣品前處理

2.3.1 供試品溶液

精密稱取0.5 g 奧美沙坦片樣品并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋定容，超聲15 min，取出搖勻。將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，放入離心機(jī)，以4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心2.5 min，取適量上清液過0.45 μm 尼龍過濾器過濾，轉(zhuǎn)移至GC 樣品瓶中待分析。

2.3.2 儲(chǔ)備溶液（10 μg/mL）

精密移取質(zhì)量濃度均為100 μg/mL 的N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）各1mL 于3 個(gè)不同的10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）

分別移取N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）的儲(chǔ)備液各1 mL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液

用甲醇逐級(jí)稀釋該混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制質(zhì)量濃度為1.25、2.5、5、10、20、40、80、100 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取試劑的選擇

比較了乙腈和甲醇的提取效果，兩者回收率均達(dá)到了95%以上。但是用乙腈作為提取試劑時(shí)會(huì)有明顯的雜質(zhì)峰（見圖1），而用甲醇提取則沒有（見圖2）。因此選擇甲醇作為提取試劑。

圖1 乙腈作為提取試劑的加標(biāo)回收?qǐng)D

圖2 甲醇作為提取試劑的加標(biāo)回收?qǐng)D

3.2 專屬性試驗(yàn)

建立的色譜/質(zhì)譜分析方法能夠準(zhǔn)確定量各潛在雜質(zhì)，雜質(zhì)與雜質(zhì)之間、雜質(zhì)與主峰、雜質(zhì)與溶劑之間不存在相互干擾。

3.2.1 空白溶液

取空白溶液（10 mL 甲醇）、NDMA、NDEA、NDIPA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、奧美沙坦供試品溶液各進(jìn)一針，確保各潛在雜質(zhì)，雜質(zhì)與雜質(zhì)之間、雜質(zhì)與主峰、雜質(zhì)與溶劑之間不存在相互干擾。

3.2.2 驗(yàn)證結(jié)果（表1）

表1 3 種化合物保留時(shí)間 單位：min

溶劑空白，奧美沙坦供試品溶液在NDEA，NDMA，NDIPA 色譜峰位置無干擾色譜峰，該分析方法專屬性良好。

3.3 線性范圍和檢出限及定量限

在上述色譜質(zhì)譜條件下，分別取2 μL N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行分析，以待測(cè)物色譜峰面積和對(duì)應(yīng)其質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3 倍信噪比確定方法的檢出限，以10 倍信噪比確定方法的定量限，相應(yīng)結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)和檢出限及定量限

3.4 加標(biāo)回收率與精密度測(cè)試

在上述氣質(zhì)色譜條件下，按本方法對(duì)一種降壓藥奧美沙坦片進(jìn)行提取分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該藥品中未檢出N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）。在該樣品中加入不同濃度的3 種亞硝胺類標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)量分別為為20 ng、200 ng，每個(gè)濃度平行測(cè)定6 次，考察方法的加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率與精密度結(jié)果

由表3 可見，N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）的平行加標(biāo)回收率為91.5%～114.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.975%～3.02%（n=6），滿足分析測(cè)試要求。

3.5 溶液穩(wěn)定性

配制質(zhì)量濃度為20 ng/mL 雜質(zhì)限度濃度的奧美沙坦溶液作為溶液穩(wěn)定性測(cè)試溶液。在室溫下，分別于0、15、18、23、43 h 進(jìn)樣分析，統(tǒng)計(jì)3 種化合物的峰面積，RSD 應(yīng)小于10%。驗(yàn)證結(jié)果見表4。

表4 三種化合物不同時(shí)間進(jìn)樣分析的峰面積和RSD 值

不同時(shí)間點(diǎn)供試品溶液的N-亞硝基二甲胺（NDMA）峰面積的RSD 為5.78%，N-亞硝基二乙胺（NDEA）峰面積的RSD 為6.67%，N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）峰面積的RSD 為4.22%，均小于10%，符合要求。

3.6 耐用性

改變色譜條件，配制加標(biāo)質(zhì)量濃度為20 ng/mL的供試品溶液，改動(dòng)條件下的3 種化合物色譜峰面積與原條件下的峰面積比值均應(yīng)在80%～120%。

標(biāo)準(zhǔn)條件：見2.2 色譜條件。

1）柱箱溫度：起始溫度38 ℃，維持0.5 min，再以20 ℃/min 的速率升溫至200 ℃，再以60 ℃/min 的速率升溫至250 ℃，維持15 min。

2）柱箱溫度：起始溫度42 ℃，維持0.5 min，再以20 ℃/min 的速率升溫至200 ℃，再以60 ℃/min 的速率升溫至250 ℃，維持15 min。

3）進(jìn)樣口溫度：248 ℃。

4）進(jìn)樣口溫度：252 ℃。

驗(yàn)證結(jié)果見表5。

表5 3 種化合物不同條件下進(jìn)樣分析的峰面積和比值

條件變動(dòng)后測(cè)試結(jié)果與原條件測(cè)試結(jié)果相比，NDMA 峰面積的比值在104.05%～105.23%之間，NDEA 峰面的比值在102.02%～104.23%，NDIPA 峰面的比值在101.31%～102.64%，符合要求。

4 結(jié)論

本文建立氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定藥品中N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）3 種亞硝胺類化合物含量的分析方法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)方法的提取試劑進(jìn)行了確定，考察了方法的線性、檢出限等參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法操作步驟簡(jiǎn)單，檢出限低，加標(biāo)回收率和精密度滿足分析測(cè)試要求，適用于N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）3 種亞硝胺類化合物含量的分析。