焦銀蕾，張曉燦，何曉晨，賈樹(shù)紅，劉立平

（河北冀衡藥業(yè)股份有限公司 河北 衡水 053000）

0 引 言

葉酸是人體細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的必需物質(zhì)，對(duì)人體的新陳代謝起著重要作用，是人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素之一，葉酸對(duì)細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)及核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)的合成起著重要的作用。但是由于天然的葉酸極不穩(wěn)定，易受陽(yáng)光、加熱的影響而發(fā)生氧化，所以真正能從食物中獲得的葉酸并不多，而合成的葉酸在數(shù)月或數(shù)年內(nèi)保持穩(wěn)定，容易吸收且人體利用度高。葉酸合成過(guò)程使用到原料為2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二）、對(duì)氨基苯甲酰谷氨酸、三氯丙酮。

2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（俗稱(chēng)氨二），分子式：C4H9N5O5S，相對(duì)分子質(zhì)量：239.21，CAS No.為35011-47-3,為生產(chǎn)原料藥葉酸的主要使用原料，其制備過(guò)程是將氰乙酸甲酯、甲醇鈉和硝酸胍混合在一起進(jìn)行縮合反應(yīng),通過(guò)添加亞硝酸鈉對(duì)混合物進(jìn)行硝化，然后還原，最后加入硫酸，得到2，4，5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二），在其生產(chǎn)過(guò)程中使用氰乙酸甲酯作原料,故在反應(yīng)不完全的情況下會(huì)有殘留，從而影響原料藥葉酸的產(chǎn)品質(zhì)量，造成殘留溶劑含量不合格。氰乙酸甲酯為無(wú)色至微黃色透明液體，可燃，為極性有機(jī)溶劑，不溶于水,可與乙醇、乙醚混溶。具有可燃性，有中等毒性,能經(jīng)皮膚吸收，可引起皮膚炎癥，需對(duì)其進(jìn)行控制，目前各國(guó)藥典均無(wú)相關(guān)檢測(cè)方法，參考工業(yè)用氰乙酸甲酯國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T26606-2011，采用氣相色譜儀進(jìn)行方法的研究，確定檢測(cè)條件，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，控制葉酸產(chǎn)品質(zhì)量。

1 實(shí) 驗(yàn)

采用氣相色譜儀進(jìn)行分析的方法稱(chēng)為氣相色譜法，氣相色譜法是用氣體作為流動(dòng)相的色譜法，該方法分析速度快、分離效率高。

氣相色譜法的原理是：樣品溶液進(jìn)樣后，首先進(jìn)入汽化室，然后在載氣的傳送作用下進(jìn)入色譜柱（載氣常用氮?dú)饣蚝猓?，不同組分在色譜柱中被分離，最后依次流出色譜柱，被檢測(cè)器檢測(cè)，得到其含量。測(cè)定樣品中某組分的含量時(shí)，需要先分析已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，然后將標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰的保留時(shí)間和峰面積與待測(cè)樣品中改該組分比對(duì)，計(jì)算待測(cè)樣品中目標(biāo)組分含量。由于樣品在氣相中傳遞速度快，因此樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間可以很快達(dá)到平衡，氣相色譜法具有分析靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)方法，需要確定檢測(cè)方法能夠?qū)⒅鞒煞趾蜌埩綦s質(zhì)及使用的溶劑進(jìn)行有效分離，獲得預(yù)期峰型，并達(dá)到分離度滿(mǎn)足要求，定量限符合控制要求的目的。

1.1 試驗(yàn)用分析儀器及試劑：

主要儀器：分析天平（賽多利斯，型號(hào)QUIN IX124-1CN）、氣相色譜儀（PE 氣相色譜儀型號(hào)Clarus 580）、SPN-300 高純度氮?dú)獍l(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）、SPH-300 高純度氫氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所），SPB-3 全自動(dòng)空氣源（北京中惠普分析技術(shù)研究所）。

試劑：氰乙酸甲酯（上海麥克林生化科技有限公司）、無(wú)水甲醇（德國(guó)默克）

1.2 試驗(yàn)條件

1.2.1 確定色譜參數(shù)

2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中殘留氰乙酸甲酯能檢測(cè)到，并且能夠達(dá)到分離要求。初步確定的色譜參數(shù)為：

色譜柱：AE.SE-54 30m*0.32mm*0.25um；柱號(hào)：S.N.03111336001；檢測(cè)器：FID；載氣：氮?dú)?；載氣流速：2.0 ml/min；進(jìn)樣量：0.5μl；檢測(cè)器溫度：240 ℃；柱箱：150 ℃；量程：1；分流比：20∶1；進(jìn)樣口溫度：240 ℃。

1.2.2 溶液配制

空白溶劑：無(wú)水甲醇

對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取氰乙酸甲酯對(duì)照品0.1 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無(wú)水甲醇溶液至刻度，搖勻。

1.2.3 測(cè)定

吸取0.5μl 無(wú)水甲醇注入氣相色譜儀中，作為空白溶劑；吸取對(duì)照品溶液0.5μl,注入氣相色譜儀中，分別記錄色譜圖。

1.2.4 結(jié)果分析

發(fā)現(xiàn)對(duì)照品溶液中氰乙酸甲酯峰保留時(shí)間為1.566 min，溶劑峰保留時(shí)間為1.194 min，放大圖譜后發(fā)現(xiàn)氰乙酸甲酯峰型出現(xiàn)峰前延現(xiàn)象，峰型不好，可能包含未分離的雜質(zhì)，色譜圖如下所示：圖1 為完整譜圖，圖2 為放大后圖譜。

圖1 氰乙酸甲酯峰型圖（保留時(shí)間1.566），完整圖譜Fig.1 Methyl cyanoacetate Sample solution chromatogram(1.566)，Complete map

圖2 氰乙酸甲酯峰型圖（保留時(shí)間1.566），放大后圖譜Fig.2 Methyl cyanoacetate Sample solution chromatogram(1.566),Magnification map

1.2.5 條件調(diào)整

其他條件不變，調(diào)整分流比：5∶1，再次進(jìn)樣。

發(fā)現(xiàn)對(duì)照中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時(shí)間為1.600 min，溶劑峰保留時(shí)間為1.204 min，和溶劑峰較近，放大圖譜后發(fā)現(xiàn)氰乙酸甲酯峰型仍不理想。色譜圖如圖3 所示。

圖3 調(diào)整分流比圖譜（對(duì)照保留時(shí)間1.600）Fig.3 Chromatogram after adjusting Separation ratio(Retention time of reference solution 1.600)

1.3 優(yōu)化氰乙酸甲酯峰型

1.3.1 調(diào)整色譜條件能夠達(dá)到分離要求

文獻(xiàn)表明，氰乙酸甲酯屬于極性有機(jī)物質(zhì)，AE.SE-54 柱子屬于弱極性柱子，故可能存在雜質(zhì)峰分離不開(kāi)的狀況，參照國(guó)標(biāo)GB-/T26606-2011工業(yè)用氰乙酸甲酯的要求，我們更換檢驗(yàn)參數(shù)及色譜柱。

調(diào)整柱溫及程序升溫：柱溫是一個(gè)重要的操作變數(shù)，直接影響分離效能和分析速度。選擇柱溫是根據(jù)混合物的沸點(diǎn)范圍，提高柱溫可縮短分析時(shí)間；降低柱溫可使色譜柱選擇性增大，有利于組分的分離和色譜柱穩(wěn)定性提高，色譜柱壽命延長(zhǎng)。一般采用等于或高于數(shù)十度于樣品的平均沸點(diǎn)的柱溫較為合適，對(duì)易揮發(fā)樣用低柱溫，不易揮發(fā)的樣品采用高柱溫。對(duì)于沸點(diǎn)分布范圍寬的多組分混合物，使用恒柱溫氣相色譜法分析，其低沸點(diǎn)組分會(huì)很快流出，峰形窄且易重疊，而高沸點(diǎn)組分則流出很慢，峰形扁平且拖尾，不利于定量測(cè)定還會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。若使用程序升溫氣相色譜法，使色譜柱溫度從低溫開(kāi)始，按一定升溫速率升溫，柱溫呈線(xiàn)性增加直至終止溫度，就會(huì)使混合物中的每個(gè)組分都在最佳柱溫(保留溫度)下流出。此時(shí)低沸物和高沸物都可在較佳分離度下流出，它們的峰寬窄適宜，并縮短總分析時(shí)間。

經(jīng)查氰乙酸甲酯沸點(diǎn)204-207 ℃，此次試驗(yàn)繼續(xù)調(diào)整程序升溫溫度、檢測(cè)溫度和速率，更換色譜柱型號(hào)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：PEG-20M 30m*0.32mm*0.25um；檢測(cè)器：FID；載氣：氮?dú)猓惠d氣流：2.0ml/min；進(jìn)樣量：0.5μl；檢測(cè)器溫度：240 ℃；柱箱：240℃；量程：1；分流比：20∶1；進(jìn)樣口溫度：240℃；柱溫：起始溫度140 ℃保持10 min，再由20℃/min 速率升到240 ℃，保持10 min。

1.3.3 溶液配制

空白溶劑：無(wú)水甲醇

對(duì)照品的制備：精密稱(chēng)取氰乙酸甲酯0.1 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無(wú)水甲醇溶液至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

1.3.4 測(cè)定

吸取0.5μl 無(wú)水甲醇注入氣相色譜儀中，作為空白溶劑；吸取對(duì)照品溶液0.5μl 注入氣相色譜儀中。經(jīng)查看圖譜，發(fā)現(xiàn)對(duì)照中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時(shí)間為8.214 min，溶劑峰保留時(shí)間為1.322 min，峰型較好，能夠有效分離，記錄色譜圖如圖4 所示。

圖4 氰乙酸甲酯峰型圖（保留時(shí)間8.214）Fig.4 Methyl cyanoacetate Sample solution chromatogram(8.214)

1.3.5 結(jié)果分析

經(jīng)查看圖譜，發(fā)現(xiàn)對(duì)照中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時(shí)間為8.214 min，溶劑峰保留時(shí)間為1.322 min，放大圖譜后發(fā)現(xiàn)氰乙酸甲酯峰型良好，無(wú)雜峰現(xiàn)象，色譜條件調(diào)整達(dá)到預(yù)期效果。

1.4 確定方法檢測(cè)限、定量限

1.4.1 檢測(cè)限定量限研究

為使雜質(zhì)峰型更理想化，其他條件不變，我們?cè)俅握{(diào)節(jié)色譜參數(shù)：起始溫度160 ℃。

根據(jù)2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 檢驗(yàn)需要，須對(duì)其進(jìn)行GC 氰乙酸甲酯的殘留量檢測(cè)，此方案主要研究2,4,5- 三氨基-6- 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中是否能檢測(cè)出氰乙酸甲酯，并且能夠達(dá)到分離要求。為確定檢驗(yàn)最小濃度我們將其對(duì)照液稀釋100 倍。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：PEG-20M 30m*0.32mm*0.25um；檢測(cè)器：FID；載氣：氮?dú)?；載氣流速：2.0 ml/min；進(jìn)樣量：0.5μl；檢測(cè)器溫度：240 ℃；柱箱：240℃；量程：1；分流比：20∶1；進(jìn)樣口溫度：240℃；柱溫：起始溫度160 ℃保持10 min，再由20℃/min 速率升到220 ℃，保持10 min。

1.4.3 溶液配制

空白溶劑：無(wú)水甲醇

對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取氰乙酸甲酯0.1 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無(wú)水甲醇溶液至刻度，再次吸取0.1ml 于10ml 容量瓶中，加入無(wú)水甲醇溶液至刻度，搖勻。

1.4.4 測(cè)定

吸取0.5μl 無(wú)水甲醇注入氣相色譜儀中，作為空白溶劑；吸取氰乙酸甲酯對(duì)照品溶液0.5μl，記錄色譜圖。

1.4.5 結(jié)果分析

經(jīng)查看圖譜，發(fā)現(xiàn)對(duì)照中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時(shí)間為4.540 min，溶劑峰保留時(shí)間為1.256 min，放大圖譜后發(fā)現(xiàn)氰乙酸甲酯峰型理想，無(wú)雜峰、前延、包峰等現(xiàn)象。計(jì)算分離度為37.5，信噪比為4，符合檢測(cè)要求，色譜如圖5 所示。

圖5 氰乙酸甲酯峰型圖（保留時(shí)間4.540）Fig.5 Methyl cyanoacetate Sample solution chromatogram(4.540)

1.4.6 專(zhuān)屬性研究

按照以上色譜條件進(jìn)行專(zhuān)屬性研究，將對(duì)照品氰乙酸甲酯和2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 樣品混合后，是否仍能檢測(cè)到氰乙酸甲酯對(duì)照品、得到預(yù)期峰型和分離效果。

對(duì)照溶液：吸取氰乙酸甲酯0.5 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無(wú)水甲醇溶液至刻度,搖勻。供試品混合溶液：精密稱(chēng)取2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 1.0 g 于10 ml 容量瓶中，吸取0.1 ml對(duì)照溶液于同一個(gè)10 ml 容量瓶中，加入無(wú)水甲醇溶液至刻度,搖勻。

測(cè)定時(shí)分別吸取空白溶劑甲醇、氰乙酸甲酯對(duì)照品溶液和過(guò)濾后供試品混合溶液的上清液，各0.5μl 分別注入氣相色譜儀,記錄所得色譜如圖6 所示，對(duì)照品保留時(shí)間4.523 min；按面積歸一法計(jì)算，混合溶液2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中氰乙酸甲酯≤0.5%范圍內(nèi)對(duì)照品和溶劑峰分離較好，保留時(shí)間穩(wěn)定，方法參數(shù)確定。

圖6 特異性色譜圖（對(duì)照溶液保留時(shí)間4.523 min）Fig.6 Specificity chromatogram(Retention time of reference solution 4.523 min)

2 驗(yàn)證方法的有效性

為驗(yàn)證方法的有效性，連續(xù)進(jìn)樣三批，2,4，5三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)條件如下。

色譜柱：PEG-20M 30m*0.32mm*0.25um；檢測(cè)器：FID；載氣：氮?dú)?；載氣流速：2.0 ml/min；進(jìn)樣量：0.5μl；檢測(cè)器溫度：240 ℃；柱箱：240℃；量程：1；分流比：20:1；進(jìn)樣口溫度：240℃；柱溫：起始溫度160 ℃保持10min，再由20℃/min 速率升到220 ℃，保持10 min。

2.1 試劑：無(wú)水甲醇。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密吸取氰乙酸甲酯0.1 ml 于10 ml 容量瓶中，加入無(wú)水甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取0.5 g 樣品于10 ml 容量瓶中，用無(wú)水甲醇溶解并稀釋至刻度；取上清液作為供試品溶液。

2.3 測(cè) 定

分別吸取空白溶劑（無(wú)水甲醇）、對(duì)照品溶液和供試品溶液各0.5μl 分別注入氣相色譜儀,記錄色譜圖，圖7 為對(duì)照溶液圖，4.435min 為對(duì)照品峰，色譜圖8 為樣品圖譜。因?yàn)闃悠分星枰宜峒柞埩糨^少故樣品圖譜中只有溶劑峰未檢測(cè)到氰乙酸甲酯。

圖7 對(duì)照溶液圖譜Fig.7 Chromatogram of reference solution

圖8 供試品溶液圖譜Fig.8 Chromatogram of testing sample

2.4 計(jì) 算

按面積歸一法計(jì)算，樣品中殘留溶劑氰乙酸甲酯≤0.5%。

3 結(jié) 語(yǔ)

經(jīng)過(guò)調(diào)整參數(shù)，最終確定檢測(cè)條件：以PEG-20M（30m*0.32mm*0.25um） 為色譜柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器，載氣流速：2.0 ml/min，進(jìn)樣量：0.5μl，檢測(cè)器溫度：240 ℃，量程：1，分流比：20∶1；在樣品檢測(cè)圖譜中，對(duì)照品溶液中氰乙酸甲酯雜質(zhì)峰保留時(shí)間為4.5 min 左右,溶劑峰保留時(shí)間為1.2 min 左右,分離度為37.5，信噪比為4，符合要求，初步確定2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中氰乙酸甲酯殘留限度為不得超過(guò)0.5%。

以上分析方法分離度、信噪比、峰型均能滿(mǎn)足檢測(cè)要求，分析方法及檢測(cè)條件初步確定，該方法能準(zhǔn)確可靠的測(cè)定2,4，5 三氨基-6 羥基嘧啶硫酸鹽（氨二） 中殘留氰乙酸甲酯的含量，為提高葉酸產(chǎn)品的質(zhì)量提供了有效保障。