賈適瑜，王飛燕，楊琳梅，耿 潔，李 峰，高 簡(jiǎn)，周 洲，程 軍（.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，北京 00037；.云南省阜外心血管病醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明 6500）

血流感染(blood stream infection,BSI)是指各種病原微生物侵入血流而引起的一種嚴(yán)重全身感染性疾病[1]。隨著侵入性操作、廣譜抗生素及免疫抑制劑等的廣泛應(yīng)用，血流感染的發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)[2]。血流感染的早期診斷對(duì)縮短住院時(shí)長(zhǎng)、減少治療費(fèi)用、降低病死率有重要意義。目前，其診斷主要依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，但存在報(bào)告時(shí)間長(zhǎng)、苛養(yǎng)菌培養(yǎng)困難等缺點(diǎn)[3-4]。分子生物學(xué)檢測(cè)具有高靈敏度、高特異度及報(bào)告時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，已成為難培養(yǎng)病原微生物檢測(cè)的重要手段。但多數(shù)分子生物學(xué)方法只能檢測(cè)某些特定類型的病原微生物[5-6]，無法滿足臨床對(duì)疑難重癥感染的診斷需求。宏基因組測(cè)序（metagenomic next generation sequencing,mNGS）技術(shù)則可在感染早期不受靶標(biāo)限制從樣本中直接檢測(cè)包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲在內(nèi)的所有病原微生物[7]。然而，血流感染患者初始病原微生物濃度在1～103CFU/ml 之間[8-9]，大量宿主核酸限制了血液中病原微生物的檢測(cè)，如何降低宿主核酸對(duì)病原微生物的影響，成為mNGS 亟需解決的問題。因此，建立高效、標(biāo)準(zhǔn)化的病原微生物核酸分離方法對(duì)于血流感染的早期診斷至關(guān)重要。本研究通過mNGS 檢測(cè)預(yù)處理后的模擬血流感染樣本，旨在評(píng)估Saponin 法、Wash 法、CD45 法和MolYsis 法四種預(yù)處理方法的去宿主效率[10-13]。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇金黃色葡萄球菌ATCC25923標(biāo)準(zhǔn)菌株模擬血流感染樣本，來自無感染患者的全血混合樣本作為基質(zhì)和陰性對(duì)照。血液樣本納入標(biāo)準(zhǔn)為：患者無發(fā)熱，血細(xì)胞檢測(cè)、血清降鈣素原、C 反應(yīng)蛋白和紅細(xì)胞沉降率結(jié)果未見異常。該研究已通過倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。研究對(duì)象均知情同意。

1.2 儀器與試劑 核酸提取選用ZymoBIOMICSDNA minipre Kit 試劑盒（ZYMO RESEARCH 公司，貨號(hào)D4300），核酸定量使用Qubit High Sensitivity dsDNA assay 試劑盒（ThermoFisher SCIENTIFIC 公司，貨號(hào)32851）。去宿主部分使用熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶HL-SAN（ActicZymes 公司，貨號(hào)70910-202），Saponin 干粉（Sigma-Aldrich 公司，貨號(hào)47036），蛋白酶K 凍干粉（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)P9460），Dynabeads?CD45 試劑盒（ThermoFisher SCIENTIFIC 公司，貨號(hào)11153D），MolYsis? Basic5 試劑盒（Molzym 公司，貨號(hào)D-301）。mNGS 部分使用Bioruptor 超聲打斷儀（Diagenode 公司，型號(hào)Bioruptor Plus），Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀（Agilent 公司，型號(hào)G2939B），Agilent High Sensitivity DNA Kit（Agilent公司，貨號(hào)5067-4626），ABI 7500 熒光定量PCR儀（ThermoFisher SCIENTIFIC 公司，型號(hào)ABI 7500），Illumina Nextseq 測(cè)序平臺(tái)（Illumina 公司，型號(hào)Nextseq 500）。

1.3 方法

1.3.1 模擬血流感染樣本制備：將ATCC25923 標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在血瓊脂平板上培養(yǎng)24h 后，制備0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?。用臨床全血混合樣本作為稀釋液，將菌懸液進(jìn)一步稀釋至105，103，102，10CFU/ml，最終制備體積為10ml 的不同濃度的模擬血流感染樣本，剩余的臨床全血混合樣本作為陰性對(duì)照。

1.3.2 四種去宿主方法處理樣本：根據(jù)方法學(xué)適用條件將檢測(cè)分為全血組和血漿組，全血組包括Saponin 法、CD45 法和MolYsis 法，血漿組包括Saponin 法、Wash 法，每份樣本進(jìn)行二次重復(fù)檢測(cè)。

1.3.2.1 Saponin 法：取8ml 模擬樣本，800r/min離心5min，轉(zhuǎn)移上層血漿至新的EP 管；將血漿9 000r/min 離心5min 后，棄上清液，吸取200μl PBS 重懸沉淀,再加入200μl 5%Saponin 溶液（5g Saponin 溶于95g 雙蒸水），37℃振蕩孵育15min，孵育過程中每2min 混勻1 次；孵育完成后加入350μl 無菌水，靜置30s，再加入12μl 5mol/L 的NaCl 溶液，渦旋混勻。8 000r/min 離心5min，棄上清液，加入100μl PBS 重懸沉淀，再加入100μl的HL-SAN buffer（5.5mol/L NaCl，100mmol/L MgCl2水溶液），渦旋混勻。加入10μl HL-SAN，立即混勻，37℃1 300r/min 孵育15min；加入1ml PBS，8 000r/min 離心3min，棄上清液；1ml PBS重懸，8 000r/min 離心3min，棄上清液，250μl PBS 重懸沉淀，重懸液用于核酸提取。

1.3.2.2 Wash 法：取8ml 模擬樣本，3 200r/min 離心30s，取血漿至新的5ml 低吸附管內(nèi),并加入等體積無菌水，渦旋混勻；室溫孵育5min，期間不斷混勻；13 300r/min 離心2min；棄上清，吸取250μl PBS 重懸沉淀，重懸液用于核酸提取。

1.3.2.3 CD45 法：具體參照Dynabeads?CD45 說明書。

1.3.2.4 MolYsis 法：具體參照MolYsis? Basic5試劑盒說明書。

1.3.3 DNA 提取和mNGS 樣本經(jīng)過預(yù)處理去宿主之后，使用Zymo BIOMICS DNA minipre Kit 試劑盒提取DNA，Qubit High Sensitivity dsDNA assay進(jìn)行核酸定量。用Bioruptor 將提取的DNA 片段化。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀及配套的Agilent High Sensitivity DNA Kit 對(duì)片段化的DNA 驗(yàn)證后制備文庫(kù)。PCR 擴(kuò)增使用ABI 7500 熒光定量PCR 儀。測(cè)序使用Illumina Nextseq 平臺(tái)，每個(gè)血流感染樣本的測(cè)序量為2.5G。測(cè)序完成后使用Burrows-Wheeler Alignment（BWA）將人基因組數(shù)據(jù)與GRCh38 進(jìn)行序列比對(duì)去除宿主基因[14]。剩余的測(cè)序數(shù)據(jù)通過SNAP 與NCBI nt 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，最終獲得靶物種reads 檢出數(shù)和豐度信息。所有mNGS 陽性結(jié)果均經(jīng)Sanger 測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Python3.9 軟件作為數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析工具，計(jì)量資料服從正態(tài)分布并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，去宿主方法組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；全血組及血漿組病原微生物核酸檢出情況組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全血組不同去宿主方法病原微生物檢出情況比較 全血組不同去宿主方法金黃色葡萄球菌reads檢出數(shù)結(jié)果見表1，可見陰性對(duì)照的reads 檢出數(shù)小于5 條；病原微生物檢出結(jié)果占比見表2。直接提取法微生物檢出占比均小于0.15%，去宿主處理可提升血流感染病原微生物的reads 檢出數(shù)，提高血流感染病原菌的占比。從檢測(cè)結(jié)果來看，Saponin法病原微生物reads 檢出數(shù)最多，微生物占比最高，其中102CFU/ml 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余濃度reads 檢出數(shù)也明顯增加，但因樣本量相對(duì)較小，樣本間差異離散度較大,導(dǎo)致差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD45 法病原微生物檢出數(shù)相比直接提取法均未顯著增加，102及103CFU/ml 樣本檢出的reads 檢出數(shù)有所降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MolYsis 法由于樣本及試劑問題，只有102和105CFU/ml 水平有檢測(cè)結(jié)果，102CFU/ml 樣本水平雖只有1 個(gè)檢測(cè)結(jié)果，其reads 檢出數(shù)相較其他方法明顯增加，105CFU/ml樣本水平reads 檢出數(shù)較其他方法亦明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見該方法具有較好的去宿主效果。

表1 全血組不同去宿主方法金黃色葡萄球菌reads 檢出數(shù)差異（±s）

注：-表示無數(shù)據(jù)。t1 和P1 為直接提取法和Saponin 法reads 檢出數(shù)比較，t2 和P2 為直接提取法和CD45 法reads 檢出數(shù)比較，t3 和P3 為直接提取法和MolYsis 法reads 檢出數(shù)比較。

稀釋濃度(CFU/ml) 直接提取法Saponin 法CD45 法MolYsis 法t1P1t2P2t3P3 0 3.50±0.71---------1015.50±3.54622.00±808.9343.00±24.04--1.08 0.47 -1.08 0.47--10221.50±6.3611 048.50±241.1216.50±3.5419 696.00-63.01 0.01 -63.01 0.01 1.29 0.42 1031 960.00±325.27 16 145.00±1292.59411.50±70--12.40 0.05 -12.40 0.05--1052 771.50±67.18 1 437 398.50±532 668.49 10 156.00±1117.23 4 681 562.00±138 810.72 -3.81 0.16 -3.81 0.16 -47.64 0.01

表2 全血組不同去宿主方法金黃色葡萄球菌占比情況（%）

2.2 血漿組不同去宿主方法病原微生物檢出情況比較 血漿組不同去宿主方法金黃色葡萄球菌reads檢出數(shù)見表3。序列比對(duì)后，不同去宿主方法金黃色葡萄球菌檢出結(jié)果占比見表4。與直接提取法相比，Saponin 法reads 檢出數(shù)最多，各水平reads 檢出數(shù)均明顯高于其他方法，但由于批內(nèi)檢測(cè)差異較大，僅105CFU/ml 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wash 法reads 檢出數(shù)低于Saponin 法，病原微生物檢出數(shù)和非宿主比例均未顯著增加，且102CFU/ml 水平reads檢出數(shù)有所丟失，檢出效果明顯不如Saponin 法。

表3 血漿組不同去宿主方法金黃色葡萄球菌reads 檢出數(shù)差異（±s）

表3 血漿組不同去宿主方法金黃色葡萄球菌reads 檢出數(shù)差異（±s）

注：-表示無數(shù)據(jù)。t1 和P1 為直接提取法和Saponin 法reads 檢出數(shù)比較，t2 和P2 為直接提取法和Wash 法reads 檢出數(shù)比較。

稀釋濃度(CFU/ml)直接提取法Saponin 法Wash 法t1P1t2P2 0 6.00±2.83------10137.50±28.99792.00±377.60814.50±729.03-3.060.20-1.570.36 102161.50±40.319 125.00±7 997.38121.00±4.24-1.580.361.290.42 1032159.50±454.6751 856.00±20 719.643 499.50±587.61-3.470.18-14.260.04 10562 295.00±5 731.812 966 242.00±42 284.9992 549.50±6 183.65-85.530.01-94.690.01

表4 血漿組不同去宿主方法金黃色葡萄球菌占比情況（%）

2.3 全血組及血漿組金黃色葡萄球菌核酸檢出情況比較 將Saponin 法和直接提取法的血漿和全血檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較（見表5），可見Saponin 法模擬樣本四個(gè)水平血漿組檢測(cè)結(jié)果均高于全血組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)，且Saponin 法血漿組金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果占比均提高至18%以上。直接法血漿組檢測(cè)結(jié)果和全血組結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。

表5 全血組及血漿組金黃色葡萄球菌核酸檢出占比情況比較

3 討論

mNGS 作為不經(jīng)培養(yǎng)直接從臨床標(biāo)本中鑒定出病原微生物的分子診斷技術(shù)，具有高靈敏度、高通量及無偏倚檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，可顯著提高疑難重癥感染的診斷效率[15-16]。然而由于mNGS 采用鳥槍法測(cè)序，大多數(shù)病原微生物的檢測(cè)會(huì)受宿主高核酸背景（通常＞99%）的影響，從而使病原微生物的檢出數(shù)據(jù)不足，大大限制了該方法的分析靈敏度。雖然增加測(cè)序深度可提高病原微生物的檢出，但當(dāng)測(cè)序深度達(dá)平臺(tái)期（約20M）后，增加測(cè)序深度不能顯著提升其檢測(cè)性能，檢測(cè)時(shí)間和成本卻大幅增加。為了避免低載量病原微生物的漏檢，減少實(shí)驗(yàn)部分的干擾，去宿主步驟成為mNGS 的重要環(huán)節(jié)。目前國(guó)內(nèi)外去宿主研究主要針對(duì)呼吸道、腦脊液等體液及其他包含微生物菌群的組織標(biāo)本類型，血流感染去宿主相關(guān)研究仍相對(duì)較少[17-19]。

血液樣本去宿主和富集微生物核酸的方法主要包括：①差速離心或過濾等基于細(xì)胞大小差異的方法去除宿主細(xì)胞；②差異裂解法選擇性裂解宿主細(xì)胞，然后用酶或化學(xué)試劑去除暴露的核酸[20]。Saponin 作為表面活性劑對(duì)人源細(xì)胞膜進(jìn)行裂解，細(xì)菌和真菌由于有細(xì)胞壁的保護(hù)可免受裂解，同時(shí)滲透壓可以差異裂解細(xì)胞膜，隨后利用高鹽溶液破壞宿主細(xì)胞釋放出的染色體，非特異性核酸內(nèi)切酶HL-SAN 對(duì)宿主核酸進(jìn)行切割，洗滌后即完成了去宿主過程[10]。Wash 法則是基于宿主細(xì)胞與微生物大小差異，使用不同離心條件對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行清除，該方法簡(jiǎn)單易操作，不需要特殊儀器設(shè)備，可去除完整性較好的人源細(xì)胞，缺點(diǎn)在于操作引入誤差較大，去宿主的均一性無法保證，多次離心及洗滌步驟減少人源核酸的同時(shí)易造成病原微生物的丟失。CD45法則是利用共價(jià)偶聯(lián)抗人CD45 抗體的超順磁性微珠，直接從全血去除CD45+白細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便省時(shí)，但無法去除不表達(dá)CD45 的白細(xì)胞。MolYsis 法使用離液劑和去污劑選擇性裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞，之后用不受離液劑和去污劑影響的DNA 酶消化，隨即對(duì)病原微生物進(jìn)行裂解，高效分離并富集目標(biāo)核酸，且不引入任何外源微生物（如工程菌），可同時(shí)富集病原菌，但是價(jià)格昂貴，本研究由于樣本及試劑問題，只有部分檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果證明該方法確實(shí)具有較好的去宿主效果，后續(xù)可用臨床樣本進(jìn)一步證實(shí)。朱盈等[21]通過對(duì)比Saponin 法、SDS 法和水洗法對(duì)血流感染樣本的去宿主效率，發(fā)現(xiàn)Saponin 法的去宿主效率最優(yōu)，與本研究結(jié)果一致。

本研究尚存在一定的局限性。首先由于不同濃度梯度的樣本量較小，宿主背景下病原檢測(cè)結(jié)果不夠穩(wěn)定，后續(xù)需要增加樣本量并使用真實(shí)樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。其次本研究只將金黃色葡萄球菌納入研究，涉及的菌譜不夠全面，后續(xù)會(huì)將革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、病毒等納入研究范圍，且充分考慮不同耐藥基因?qū)NGS 檢測(cè)的影響。未來將對(duì)mNGS 的靈敏度、重復(fù)性和特異度等方法學(xué)性能進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證，評(píng)估血流感染mNGS 檢測(cè)的全流程。

綜上，本研究通過比較Saponin 法、Wash 法、CD45 法和MolYsis 法四種預(yù)處理方法的去宿主干擾效應(yīng)，明確了Saponin 法血漿組的去宿主效率最高。為后續(xù)mNGS 的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)血流感染的早期精準(zhǔn)診斷具有重要意義。