高艷超，王 巖，柳 越，孫永艷（朝陽市第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧朝陽 122000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是一種代謝性骨病，多種因素造成患者骨量丟失，骨密度、強度降低，骨結(jié)構(gòu)破壞，增加患者骨折風險[1]。引起骨質(zhì)疏松的原因較多，其中與中老年婦女絕經(jīng)有關(guān)的骨質(zhì)疏松癥稱為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)。我國目前骨質(zhì)疏松癥病例超過7 千萬例，其中50 歲以上女性患者約占20.7%[2]。研究認為絕經(jīng)時雌性激素的丟失和卵巢功能衰退是引起骨質(zhì)加速流失的影響因素，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患病率約為未絕經(jīng)的2～3 倍[3]。鹽誘導激酶（salt-inducible kinase，SIK）是一種AMPK 家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在能量、細胞代謝中發(fā)揮重要作用[4]。SIK2 被證實能夠參與調(diào)控細胞自噬體成熟及自噬過程[5]。Smad 泛素化調(diào)節(jié)因子1(smad ubiquitination regulator 1,SMURF1)是泛素連接酶Hect 家族新成員，可誘導Smad1，Smad5 泛素化及降解，與骨質(zhì)疏松癥患者發(fā)生發(fā)展及骨代謝關(guān)系密切[6]?；诖吮狙芯客ㄟ^分析絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清SIK2 和SMURF1 表達水平，探討其與患者骨代謝、骨密度的關(guān)系，以期揭示可能的作用機制，為臨床研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取朝陽市第二醫(yī)院2019 年4月～2021 年4 月收治的154 例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者作為研究組，年齡50～68（59.76±7.21）歲，絕經(jīng)時間3～8（5.24±1.20）年，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）20.67～25.76（23.82±1.80）kg/m2； 基礎(chǔ)疾病：高血壓史24 例，糖尿病史46 例。另選取同時期在我院體檢的150 例絕經(jīng)后健康女性作為對照組，年齡50～69（59.83±7.17）歲，絕經(jīng)時間3～8（5.14±1.30）年；BMI 20.87～25.79（23.62±1.78）kg/m2；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕菏?1 例，糖尿病史38 例。兩組年齡（t=0.086，P=0.932）、絕經(jīng)時間（t=0.697，P=0.486）、BMI（t=0.974，P=0.331）、高血壓史（χ2=1.324，P=0.250）、糖尿病史（χ2=0.782，P=0.376）比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。納入標準：①患者符合骨質(zhì)疏松診斷標準：雙能X 射線骨密度儀測定骨密度T 值≤-2.5；②自然絕經(jīng)一年以上女性，骨質(zhì)疏松患病原因與雌性激素水平波動有關(guān)。③年齡范圍50～70 歲；④未接受過影響骨代謝藥物治療；⑤患者自愿簽署研究知情同意書。排除標準：①絕經(jīng)前患有骨質(zhì)疏松癥；②內(nèi)分泌紊亂相關(guān)疾病引發(fā)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松；③入組半年內(nèi)使用過影響骨代謝藥物；④并發(fā)其他骨疾?。虎莶l(fā)免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾?。虎薏l(fā)嚴重臟器功能障礙及感染性疾??；⑦患者臨床資料缺失及不能自主配合研究者。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 儀器與試劑 本研究主要儀器有QuantStudioTM3實時熒光定量PCR 儀（北京宏達恒業(yè)科技有限公司），雙能X 射線骨密度檢測儀（徐州品源電子科技有限公司，BMD-A5），全自動化學發(fā)光免疫分析儀（上海智巖科學儀器有限公司，AUTOAE2100）。主要試劑有總RNA 提取劑（Trizol）、骨鈣素試劑盒、Ⅰ型膠原氨基端前肽試劑盒、β-膠原降解產(chǎn)物試劑盒、甲狀旁腺素試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；鼠抗人SIK2 單克隆抗體、鼠抗人SMURF1 單克隆抗體（上海群己生物科技有限公司）；骨橋蛋白試劑盒、25-OH-D 試劑盒（上海臻科生物科技有限公司）。

1.3 方法 抽取受檢者清晨空腹肘部靜脈血3 ml，3 000 r/min 離心10 min 后吸取上清液，置于-20℃保存待測。取血清樣本以qRT-PCR 法檢測血清SIK2 和SMURF1 表達水平，使用Trizol 提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進行PCR 擴增，以GAPDH 作內(nèi)參。SIK2 上游引物：5’-TCCTGCTTCCTGTCAC TAT-3’，下游引物：5’-TCCACGGCTTCTACCATT-3’；SMURF1 上游引物：5’-ATCCCTGGTACAGC GACTCCGAAATCCT-3’，下游引物：5’-GTCCCTGC ACTGTTGTCCTTTGCTCATA-3’；GAPDH 上游引物：5’-TGGTGCTGAGTATGTCGTGG-3’，下游引物：5’-GGTTCACACCCATCACAAAC-3’。反應(yīng)條件：95℃90 s（預變性）；95℃60 s（變性），60℃30 s（退火），75℃30 s（延伸），共進行40 個循環(huán)。SIK2，SMURF1 相對表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。以電化學發(fā)光法檢測骨鈣素（osteocalcin，OC）、25 羥基維生素D（25-hydroxyvitamin D，25-OHD）、Ⅰ型膠原氨基端前肽（N-terminal propeptide of type Ⅰ procollagen，PINP）、β- 膠原降解產(chǎn)物（bate C-terminal cross-linked telopeptids of typeⅠ collagen，β-CTx）、甲狀旁腺素（parathyroid hormone，PTH）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）水平，具體操作嚴格按照操作說明進行。通過雙能X 射線骨密度儀對兩組研究對象的股骨頸、腰椎L1～4 進行骨密度測定。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗分析兩組間計數(shù)資料；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗分析兩組間計量資料；用Pearson 相關(guān)法分析血清SIK2，SMURF1 表達水平與骨代謝指標、骨密度的相關(guān)性；Logistic 回歸分析絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響因素；受試者工作特征（ROC）曲線分析血清SIK2，SMURF1 對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預測價值。α=0.05 為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清SIK2，SMURF1，骨代謝指標、骨密度水平比較 見表1。與對照組相比，研究組血清25-OH-D 水平以及腰椎L1～4、股骨頸骨密度水平均顯著降低，血清OPN，PTH，SIK2，β-CTX，OC，PINP 及SMURF1 表達水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表1 兩組血清SIK2，SMURF1，骨代謝指標、骨密度水平比較（±s）

表1 兩組血清SIK2，SMURF1，骨代謝指標、骨密度水平比較（±s）

項 目對照組（n=150）研究組（n=154）t 值P 值SIK20.79±0.170.94±0.167.9240.000 SMURF10.66±0.160.93±0.2211.7590.000骨代謝指標PINP（ng/ml）36.47±4.6241.28±4.689.0160.000 OPN（ng/ml）16.78±2.6918.67±3.175.5980.000 β-CTx（pg/ml）4.28±0.845.12±0.968.1110.000 OC（ng/ml）13.28±2.1415.64±2.738.3740.000 25-OH-D（ng/ml）14.31±2.6212.07±2.767.2540.000 PTH（pg/ml）64.31±8.2471.26±8.887.0690.000骨密度（g/cm3） 腰椎L1～40.86±0.210.71±0.206.3780.000股骨頸0.82±0.190.61±0.189.8950.000

2.2 血清SIK2，SMURF1 表達水平與骨代謝指標、骨密度的相關(guān)性 見表2。血清SIK2 與OPN，OC，SMURF1，β-CTx，PINP 呈正相關(guān)（均P＜0.05），SMURF1 與β-CTx，PINP，OPN，PTH，OC 呈 正相關(guān)（均P＜0.05）；血清SIK2，SMURF1 與25-OHD，股骨頸骨密度均呈明顯負相關(guān)（均P＜0.05）。

表2 血清SIK2，SMURF1 表達水平與骨代謝指標、骨密度的相關(guān)性

2.3 Logistic 回歸分析絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響因素見表3。以絕經(jīng)后是否發(fā)生骨質(zhì)疏松（賦值：絕經(jīng)后健康=0，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松=1）作為因變量，將上述檢測指標（均為連續(xù)變量）作為自變量，進行Logistic 回歸分析。結(jié)果顯示，SIK2，SMURF1，PINP，OPN，OC 和股骨頸骨密度是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的影響因素（均P＜0.05）。

表3 Logistic 回歸分析絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響因素

2.4 血清SIK2，SMURF1 對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預測價值 見表4 和圖1。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，二者聯(lián)合預測的AUC 顯著大于SIK2 單獨預測的AUC（Z=3.339，P＜0.001），與SMURF1 單獨預測的AUC 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 血清SIK2，SMURF1 預測絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的ROC 曲線

表4 血清SIK2，SMURF1 對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預測價值

3 討論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥與年齡相關(guān)，女性絕經(jīng)后卵巢功能減退、雌激素缺失是骨質(zhì)疏松的發(fā)病因素，導致患者破骨細胞活性增加，破壞骨結(jié)構(gòu)[7]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者主要臨床癥狀表現(xiàn)為臥位痛、翻身痛、起坐痛及行走痛，并常伴有局部壓痛或叩擊痛，易發(fā)生骨骼畸形和骨折[8]，對患者生活造成極大負擔?，F(xiàn)有研究認為，雌激素缺乏、氧化應(yīng)激等因素是引發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響因素[9]，但其發(fā)病機制仍不清晰。因此，本研究探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清SIK2，SMURF1 與骨代謝指標、骨密度的相關(guān)性，以期為臨床診斷和預防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供技術(shù)參考。

SIK2是AMPK磷酸激活蛋白酶家族中的成員。研究認為SIK2 表達升高與細胞自噬體成熟及自噬反應(yīng)有關(guān)[10]，SIK2 表達下調(diào)可抑制細胞異常自噬，減輕細胞損傷程度。巨噬細胞活性與機體炎癥反應(yīng)程度及機體免疫相關(guān)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者炎癥因子水平升高，激活巨噬細胞極化，介導促炎因子大量釋放，加重炎癥反應(yīng)程度，引起組織損傷，破骨細胞活性、骨吸收增強，使機體免疫能力下降[11]。經(jīng)炎癥因子激活后的巨噬細胞能夠促進SIK2產(chǎn)生，提高其表達水平。本研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清SIK2 表達水平升高。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者SIK2 水平升高可能與巨噬細胞活性增強、機體免疫能力降低、骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）衰老、成骨細胞分化受限、骨量丟失有關(guān)[12]。也有研究表示，自噬水平低促進損傷，骨質(zhì)疏松患者BMSCs 的自噬水平低于正常健康細胞，抑制患者成骨分化能力[13]。SMURF1是泛素連接酶家族成員，通過泛素化降解骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP），高水平SMURF1 抑制BMP 信號傳導，抑制BMSCs 的成骨分化，降低骨強度，促進骨量丟失和骨礦化，引起骨質(zhì)疏松下調(diào)SMURF1 水平促進BMP 釋放，加速成骨細胞分化，減少細胞凋亡[14]。

絕經(jīng)后女性雌激素水平降低是骨質(zhì)疏松發(fā)生的影響因素，給予絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者激素治療，明顯改善患者癥狀[15]。SIK2 與卵巢正常功能和生育能力關(guān)系密切，敲除SIK2 基因促進性腺激素誘導卵巢細胞分化，產(chǎn)生雌二醇，使促卵泡激素（FSH）水平極大程度提升[16]。SMURF1 是泛素酶家族成員，參與調(diào)控機體多種代謝通路。研究認為SMURF1 參與調(diào)控骨代謝過程中重要的信號轉(zhuǎn)導過程，動物實驗進一步表明降低小鼠體內(nèi)雌激素水平，抑制骨吸收，增強破骨細胞活性，致使轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）/Smad 信號通路異常，引起機體SMURF1 水平升高，最終導致骨質(zhì)疏松[17]。本研究結(jié)果顯示，SIK2，SMURF1 表達水平升高與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生關(guān)系密切，高水平SIK2 誘導卵巢雌激素分泌異常，激活機體巨噬細胞活性，促進炎性介質(zhì)釋放，造成異常自噬引起患者成骨細胞與破骨細胞間平衡紊亂，骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)破壞，致使SMURF1水平升高，進一步破壞骨結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)，增強破骨細胞活性，損傷機體組織，降低免疫抵抗力[18]，最終導致骨質(zhì)疏松。

骨代謝指標水平異常影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生，研究結(jié)果顯示，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清PINP，β-CTx，OPN 及PTH 水平升高，25-OH-D水平降低，SIK2，SMURF1 與PINP，OPN，β-CTX，OC，PTH 呈正相關(guān)，與25-OH-D，股骨頸骨密度呈負相關(guān)。PINP 水平變化能夠一定程度反映骨代謝水平[19]，絕經(jīng)后雌激素水平降低，骨形成量低于骨吸收量，使PINP 水平升高。β-CTx 水平與破骨細胞活性相關(guān)，其水平隨患者骨吸收加強而升高[20]，破骨細胞活性增加，激活巨噬細胞促進促炎因子釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)使得機體免疫功能降低，加劇組織損傷。OC 是影響骨周轉(zhuǎn)率的指標，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松屬于高轉(zhuǎn)化型導致OC 水平升高[21]。血清25-OH-D 是骨代謝調(diào)節(jié)的重要因素，反映人體鈣水平，骨質(zhì)疏松患者維生素D 水平低，骨鈣含量低，脆性增加提高骨折發(fā)生風險[22]。PTH參與調(diào)節(jié)血鈣，一定程度增強破骨細胞活性，刺激成骨細胞作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者股骨頸、腰椎L1～4 骨密度明顯降低，絕經(jīng)后女性雌激素水平降低，卵巢功能衰減影響骨代謝活動，降低骨密度。本研究證實了血清中高水平SIK2，SMURF1 是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響因素，二者聯(lián)合預測絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松具有較好效能。高水平SIK2 介導機體異常自噬，誘導促炎因子釋放，激活巨噬細胞活性，加重炎癥反應(yīng)程度，促進組織損傷。SMURF1 水平升高負調(diào)控BMP 因子釋放，減弱成骨細胞分化及骨代謝，促進骨量丟失，導致骨質(zhì)疏松。臨床可將血清SIK2，SMURF1 指標應(yīng)用于預測絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生，并可通過特異治療調(diào)控二者表達水平，為臨床治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供指導方向。綜上所述，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血清SIK2，SMURF1 異常過表達，且與PINP，OPN，β-CTx，OC 和PTH 呈正相關(guān)，與25-OH-D 和股骨頸骨密度呈負相關(guān)。然而本研究僅從宏觀角度出發(fā)探討以上指標的相關(guān)性，研究切入點不夠深刻，還需進一步研究SIK2，SMURF1 與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松間的作用機制及其與患者預后的關(guān)系。