夏慧娟，付小梅，陳秋月（內(nèi)江市第一人民醫(yī)院兒科，四川內(nèi)江 641000）

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童肺炎常見的類型，具有變形性強(qiáng)、直徑小等特點(diǎn)，兒童自身抵抗力差，更易引起MP 感染，誘發(fā)哮喘，影響生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。大量研究發(fā)現(xiàn)兒童哮喘與MP 感染密切相關(guān)，臨床上能夠有效評(píng)估MP 患兒病情，及時(shí)調(diào)整治療方案，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患兒預(yù)后情況對(duì)提高患兒預(yù)后生活質(zhì)量具有重要的意義[3]。miRNAs 參與調(diào)控機(jī)體各項(xiàng)生理活動(dòng)，與機(jī)體多種疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，對(duì)維持機(jī)體穩(wěn)定平衡發(fā)揮重要調(diào)控作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)微小核糖核酸(micro RNA,miR)-424-5p 表達(dá)水平與多種疾病發(fā)生密切相關(guān)，例如卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌等，但miR-424-5p 與MP 感染的相關(guān)性尚未被深入研究[6-7]。不規(guī)則趨化因子人驅(qū)動(dòng)蛋白（CX3CL1）結(jié)構(gòu)特殊，既可以與受體CX3CR1 結(jié)合參與細(xì)胞間黏附，也可與其他炎性因子協(xié)同作用增強(qiáng)細(xì)胞間趨化作用[8]。CX3CL1 與其受體CX3CR1 共同作用影響著多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，與多種疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[9]。目前，CX3CL1 表達(dá)在MP 誘發(fā)哮喘發(fā)病過程中的作用機(jī)制尚未被研究，本研究擬通過檢測(cè)MP 感染誘發(fā)哮喘患兒血清miR-424-5p 和CX3CL1 表達(dá)水平變化，分析二者與患兒預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2020 年3 月～2021 年5 月在內(nèi)江市第一人民醫(yī)院確診并進(jìn)行治療的128 例MP感染患兒，根據(jù)是否誘發(fā)哮喘分為哮喘組和MP 組。哮喘組82 例，男性44 例，女性38 例，年齡2～9（5.67±0.91）歲；MP 組46 例，男性22 例，女性24 例，年齡3～9（5.49±0.86）歲；對(duì)照組為50例健康兒童，男性23 例，女性27 例，年齡2～10（5.75±1.08）歲。三組兒童年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2/F=0.949,0.846,均P＞0.05），收集整理所有患者的臨床基本資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①哮喘組和MP 組患兒經(jīng)MP 抗體檢測(cè)均為陽性；②無其它病原體引起的感染；③患兒監(jiān)護(hù)人已了解本次研究，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①支氣管發(fā)育不良或畸形的患兒；②其它原因引發(fā)的哮喘患兒；③伴有其它血液系統(tǒng)疾病者；④伴有嚴(yán)重自身免疫性疾病者。本研究已經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司）；CX3CL1 檢測(cè)試劑盒（廣州奧瑞達(dá)生物科技有限公司）；IgE，IL-6 和TNF-α 檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；7500 熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）；ReadMax 1900Plus 型光吸收全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；PowerCube 肺功能測(cè)試儀（德國(guó)GANSHORN 公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：采集所有患兒清晨空腹靜脈血4～6 ml，4℃，3 500 r/min 離心15 min，分離血清置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)血清中miR-424-5p 相對(duì)表達(dá)量。使用Trizol 試劑盒提取各組血清中的總RNA，然后將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒操作說明進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，70℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。引物序列見表1，以U6 作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct值表示相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法：采用酶聯(lián)免疫吸附法分別檢測(cè)血清CX3CL1，免疫球蛋白E（immunoglobulin E，Ig E），白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 肺功能指標(biāo)檢測(cè)：采用肺功能測(cè)試儀檢測(cè)患兒肺活量（VC）、用力肺活量（FVC）和第一秒用力呼氣容積（FEV1）指標(biāo)，各指標(biāo)測(cè)量三次取平均值。

1.3.5 隨訪觀察：所有患兒預(yù)后均進(jìn)行為期12 個(gè)月的隨訪觀察，患兒臨床特征、體征和CT 檢查正?；蚧净謴?fù)正常的視為預(yù)后良好組（n=50），出現(xiàn)復(fù)發(fā)或其它情況的為預(yù)后不良組（n=32）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用snk-q檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier 法分析MP 誘發(fā)哮喘患兒血清中miR-424-5p 和CX3CL1 的表達(dá)與患兒預(yù)后的關(guān)系，對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行組間生存曲線差異分析，采用多因素Logisitic 回歸分析MP 誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后影響因素，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘組、MP 組和對(duì)照組血清miR-424-5p，CX3CL1，Ig E，IL 6 和TNF α 水平分析 見表2。對(duì)照組、MP 組和哮喘組患兒血清miR-424-5p，CX3CL1，Ig E，IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平依次升高，且組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 哮喘組、MP 組和對(duì)照組血清miR-424-5p，CX3CL1，Ig E，IL-6 和TNF-α 水平（±s）

表2 哮喘組、MP 組和對(duì)照組血清miR-424-5p，CX3CL1，Ig E，IL-6 和TNF-α 水平（±s）

注：*與對(duì)照組相比，t=3.385,8.843,5.839,19.501,14.560; 26.417,19.106,28.324,10.920,18.672,均P＜0.05；#與MP 組相比，t=4.859,12.519,9.583,6.400,6.076,均P＜0.05。

項(xiàng)目對(duì)照組（n=50）MP 組（n=46）哮喘組（n=82）FP miR-424-5p0.95±0.261.12±0.35*1.34±0.39*#20.2870.000 CX3CL1（ng/ml）0.47±0.080.62±0.17*0.91±0.22*#103.2740.000 IgE（IU/ml）22.64±5.7441.26±8.91*52.31±10.26*#174.4700.000 IL-6（ng/L）5.26±0.908.24±1.07*9.14±1.18*#205.3170.000 TNF-α（pg/ml）55.27±10.5488.56±18.67*105.26±26.48*#87.3490.000

2.2 哮喘組、MP 組和對(duì)照組肺功能指標(biāo)分析 見表3。對(duì)照組、MP 組和哮喘組患兒肺功能指標(biāo)VC，F(xiàn)VC 和FEV1 依次下降，且組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 哮喘組、MP 組和對(duì)照組肺功能指標(biāo)（±s）

表3 哮喘組、MP 組和對(duì)照組肺功能指標(biāo)（±s）

注：*與對(duì)照組相比，t=8.037,14.825,8.353; 15.723,10.653,15.676,均P＜0.05；#與MP 組相比，t=5.526,6.051,3.454,均P＜0.05。

指標(biāo)對(duì)照組（n=50）MP 組（n=46）哮喘組（n=82）FP VC（ml）80.24±19.3562.35±15.48*51.26±12.38*#54.9430.000 FVC（%）78.35±18.2960.21±16.34*48.36±11.73*#61.8210.000 FEV1（%）63.31±17.2644.26±10.31*38.69±9.58*#63.0060.000

2.3 哮喘組患兒預(yù)后與臨床病理特征分析 見表4。預(yù)后良好組患兒血清Ig E，IL-6，TNF-α，miR-424-5p 和CX3CL1 水平均明顯低于預(yù)后不良組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.086～6.137，均P＜0.05）。

表4 哮喘組患兒預(yù)后與臨床病理特征分析[±s，n(%)]

表4 哮喘組患兒預(yù)后與臨床病理特征分析[±s，n(%)]

類別預(yù)后良好組（n=50）預(yù)后不良組（n=32）t/χ2P年齡（歲）5.60±0.845.78±0.810.9600.340性別 男23（46.00）21（65.63）3.0220.082女27（54.00）11（34.37）鼻炎史 有26（52.00）18（56.25）0.1420.707無24（48.00）14（43.75）過敏史 有22（44.00）17（53.13）0.6510.420無28（56.00）15（46.87）Ig E（IU/ml）48.32±10.6958.54±13.373.8250.000 IL-6（ng/L）8.51±1.0910.12±1.266.1370.000 TNF-α（pg/ml）98.43±22.41115.92±28.693.0860.003 miR-424-5p1.22±0.321.54±0.404.0030.000 CX3CL1（ng/ml）0.78±0.201.12±0.316.0440.000

2.4 MP 感染誘發(fā)哮喘患兒血清miR-424-5p，CX3CL1 表達(dá)與患兒預(yù)后關(guān)系分析 見圖1，圖2。采用Kaplan-Meier 法分析MP 感染誘發(fā)哮喘患兒血清miR-424-5p，CX3CL1 水平與患兒預(yù)后的關(guān)系，以哮喘患兒血清miR-424-5p，CX3CL1 水平平均值為截?cái)嘀?，血清miR-424-5p ≤1.34 為低表達(dá)，＞1.34 為高表達(dá)；CX3CL1 ≤0.91 ng/ml 為低表達(dá)，＞0.91 ng/ml 為高表達(dá)。結(jié)果顯示哮喘患兒血清中miR-424-5p 低表達(dá)組預(yù)后良好率為81.82%，明顯高于高表達(dá)組預(yù)后良好率36.84%（χ2=4.377，P＜0.05）；哮喘患兒血清中CX3CL1 低表達(dá)組預(yù)后良好率為79.17%，明顯高于高表達(dá)組預(yù)后良好率35.29%（χ2=4.172，P＜0.05）。

圖1 哮喘患兒血清miR-424-5p 與預(yù)后關(guān)系

圖2 哮喘患兒血清CX3CL1 與預(yù)后關(guān)系

2.5 多因素Logisitic 回歸分析MP 感染誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后影響因素 見表5。以哮喘患兒預(yù)后情況作為因變量（預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1），以2.3單因素分析結(jié)果中具有顯著性差異的指標(biāo)作為自變量，IgE，IL-6，TNF-α，miR-424-5p 和CX3CL1均為連續(xù)變量。多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，Ig E，IL-6，TNF-α，miR-424-5p 和CX3CL1 水平為MP誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后不良的影響因素（P＜0.05）。

表5 多因素Logisitic 回歸分析MP 感染誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后影響因素

3 討論

MP 感染是目前引起兒童肺炎的主要原因，我國(guó)5 歲以下兒童獲得性肺炎中約7.1%是由MP感染引起的[10]。MP 感染與兒童哮喘發(fā)病密切相關(guān)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，MP 感染引起的哮喘占兒童哮喘的47.60%[11]。MP 是介于病毒和細(xì)菌之間的一種原核微生物，MP 會(huì)釋放一些引起巨噬細(xì)胞以及單核細(xì)胞等炎癥相關(guān)細(xì)胞浸潤(rùn)的物質(zhì)，加重氣道炎癥反應(yīng)，引起氣道變態(tài)反應(yīng)引發(fā)哮喘[12]。MP 感染誘發(fā)哮喘患兒機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，機(jī)體感染MP 后促進(jìn)炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)，破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，加速病情的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，MP 感染誘發(fā)哮喘患兒的血清免疫球蛋白水平異常表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能被抑制，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)水平異常，機(jī)體宿主細(xì)胞膜抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成免疫復(fù)合物，引發(fā)機(jī)體出現(xiàn)病理損傷[13]。血清IgE 主要在呼吸道黏膜上由B 細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，IgE 表達(dá)會(huì)顯著增高[14]。IL-6 和TNF-α 均為機(jī)體炎癥相關(guān)因子，TNF-α 主要調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境平衡，機(jī)體出現(xiàn)炎癥感染時(shí)TNF-α 水平會(huì)明顯升高，IL-6 炎癥因子與多種疾病發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)IL-6 表達(dá)異常，其表達(dá)水平隨炎癥程度變化而變化[15]。劉翠蘭等[16]研究報(bào)道，MP 感染組哮喘患兒IgE，IL-6 和TNF-α 水平顯著高于非MP 感染組和健康兒童，MP 感染組、非MP 感染組和健康兒童肺功能相關(guān)指標(biāo)依次降低，且哮喘發(fā)生與血清IgE，IL-6 和TNF-α 水平升高有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，哮喘組、MP 感染組和對(duì)照組血清IgE，IL-6 和TNF-α 水平依次降低，肺功能相關(guān)指標(biāo)依次升高，其表達(dá)水平均為MP 誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后不良的影響因素，提示血清炎癥因子IgE，IL-6 和TNF-α 水平與MP 感染誘發(fā)哮喘密切相關(guān)，與既往研究結(jié)果一致。

miRNA 屬于內(nèi)源性，具有調(diào)控功能的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 的3’-非編碼區(qū)特異性結(jié)合，降解或中斷mRNA 的翻譯，從而調(diào)控基因翻譯過程[17-18]。大量研究表明，MP 感染和哮喘都會(huì)引起多種miRNA 異常表達(dá)，例如miR-492，miR-141-3p 等，miRNA 可通過調(diào)控單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)免疫炎性因子（IL-6，TNF-α 等）的分泌在MP 感染誘發(fā)哮喘病情發(fā)展過程中發(fā)揮作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-424-5p 在多種疾病發(fā)生發(fā)展過程中異常表達(dá)。王梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-424-5p 在結(jié)直腸癌患者血清中表達(dá)異常升高，高水平miR-424-5p與病情發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，MP 組、哮喘組患兒血清miR-424-5p 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，miR-424-5p 低表達(dá)患兒預(yù)后良好率顯著高于高表達(dá)患兒，且miR-424-5p 水平為MP 誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后不良的影響因素，提示miR-424-5p水平與MP 感染誘發(fā)哮喘患兒病情發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)水平影響患兒預(yù)后。

CX3CL1 屬于CX3C 趨化家族一員，其特異性受體為CX3CR1，CX3CL1 分為膜結(jié)合型和分泌型兩類，機(jī)體內(nèi)主要發(fā)揮黏附和趨化兩大作用[21]。CX3CL1 廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞組織中，其與CX3CR1 結(jié)合刺激炎性因子釋放，促使機(jī)體炎癥反應(yīng)加重[22]。據(jù)報(bào)道，CX3CL1 在多種炎癥性疾病中過度表達(dá)，例如：慢性阻塞性肺疾病，神經(jīng)炎癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，但在哮喘疾病中發(fā)揮的作用尚未被研究[23]。梁麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病患者血清中CX3CL1 水平明顯升高，其水平變化與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可根據(jù)其表達(dá)水平評(píng)價(jià)患者預(yù)后效果。本研究結(jié)果顯示，MP 組、哮喘組患兒血清CX3CL1 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，CX3CL1 低表達(dá)患兒預(yù)后良好率顯著高于高表達(dá)患兒，CX3CL1 水平為MP 誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后不良的影響因素，提示CX3CL1 表達(dá)水平影響MP 感染誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后情況。

綜上所述，MP 感染誘發(fā)哮喘患兒血清miR-424-5p 和CX3CL1 表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)水平影響患兒預(yù)后情況，檢測(cè)兩者表達(dá)水平對(duì)MP 感染誘發(fā)哮喘患兒預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值。