覃熙媛，朱 瑩，李偉滔，鄭曉玲，梁遠(yuǎn)秋

（南方醫(yī)科大學(xué)第十附屬醫(yī)院/東莞市人民醫(yī)院病理科，廣東 東莞 523058）

上皮性卵巢癌是最常見的卵巢癌類型，因極容易發(fā)生盆腔及腹腔內(nèi)廣泛播散轉(zhuǎn)移，上皮性卵巢癌死亡率一直處于惡性婦科腫瘤前列[1]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）已被證實(shí)在上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，上皮細(xì)胞EMT 過程受到多種基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)節(jié)[2]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1（forkhead box M1，F(xiàn)oxM1）是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在細(xì)胞周期調(diào)控和維持染色體穩(wěn)定中具有重要作用，是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的重要因子。已有研究發(fā)現(xiàn)FoxM1 在多種惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移中具有明顯的促進(jìn)作用[3]，F(xiàn)oxM1 高表達(dá)能夠明顯促進(jìn)鼻咽癌[4]、非小細(xì)胞肺癌[5]細(xì)胞增殖和EMT。但FoxM1 在上皮性卵巢癌EMT過程中的作用尚無相關(guān)報(bào)道，故本研究以上皮性卵巢癌、卵巢交界性腫瘤患者作為研究對象，探討了卵巢腫瘤組織中FoxM1的表達(dá)與患者病理指標(biāo)和EMT兩個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志物——E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集2018年1月—2020年12月東莞市人民醫(yī)院收治并手術(shù)切除的上皮性卵巢癌石蠟存檔標(biāo)本41例，其中，高級別漿液性癌22例、低級別漿液性癌5例、透明細(xì)胞癌7 例、黏液性癌5 例、內(nèi)膜樣癌2 例；年齡23～78 歲，中位年齡51 歲；臨床分期：采用FIGO 分期，I～I(xiàn)I 期23 例、III～I(xiàn)V 期18 例；有脈管瘤栓6 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)切除組織病理學(xué)診斷為上皮性卵巢癌；②術(shù)前未接受放療、化療、免疫治療等相關(guān)治療；③臨床資料完整。排除合并其他惡性腫瘤者。并收集同期卵巢交界性腫瘤石蠟存檔標(biāo)本17 例，其中交界性漿液性腫瘤12 例、交界性黏液性腫瘤5 例；年齡24～58 歲，中位年齡43 歲。選擇同期行子宮肌瘤手術(shù)患者的正常卵巢組織20例作為對照，年齡54～79歲，中位年齡62.5歲。

1.2 試劑與儀器

鼠抗人FoxM1 單克隆抗體購自美國Abcam 公司，兔抗人E-cadherin、鼠抗人vimentin 單克隆抗體、免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB染色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BX41型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 方 法

1.3.1 資料收集收集患者年齡、腫瘤組織大小、病理分期、組織學(xué)分型、有無脈管瘤栓、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等資料。本研究經(jīng)東莞市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（KYKT2020-052）。

1.3.2 免疫組化檢測組織中FoxM1、E-cadherin、vimentin 蛋白表達(dá)將手術(shù)切除組織進(jìn)行石蠟包埋后切成3 μm厚度薄片，采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶免疫組化染色法（S-P）檢測相應(yīng)組織中FoxM1、Ecadherin和vimentin蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。分別以已知FoxM1、E-cadherin和vimentin 陽性的卵巢癌樣本作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3.3 免疫組化結(jié)果判讀將細(xì)胞特定位置呈淺黃色至棕黃色的細(xì)小顆粒視為陽性，其中FoxM1定位于細(xì)胞核中，E-cadherin 蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，vimentin 蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。陽性表達(dá)的分級采用兼顧陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比的判斷標(biāo)準(zhǔn)，選取5 個(gè)400 倍視野，當(dāng)陽性細(xì)胞比例≤10%者評定為0分，＞10%～25%者評定1分，＞25%～50%者評定為2分，＞50%～75%者評定為3分，＞75%者評定為4 分；不顯色或顯色模糊者評定為0 分，淺黃色者評定為1 分，棕黃色者評定為2 分，棕褐色者評定為3 分。陽性細(xì)胞數(shù)結(jié)果與染色強(qiáng)度結(jié)果相乘即得最終的染色總分。FoxM1 與E-cadherin 的染色總分≥4分時(shí)為高表達(dá)，＜4分時(shí)為低表達(dá)[6-8]。vimentin的染色總分≥2分時(shí)為高表達(dá)，＜2分為低表達(dá)[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件對本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析。計(jì)數(shù)資料表示為例數(shù)（百分比），組間比較進(jìn)行卡方檢驗(yàn)；等級資料多組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組間采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用Spearman 分析FOXM1、E-cadherin 和vimentin 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，并采用四格表關(guān)聯(lián)分析計(jì)算Phi 系數(shù)（φ）進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 上皮性卵巢癌組織、卵巢交界性腫瘤及正常卵巢組織中FoxM1蛋白表達(dá)情況

上皮性卵巢癌組織中FoxM1 蛋白陽性表達(dá)率為95.12%，其中高表達(dá)的有21例，占全部卵巢癌組織的51.22%；卵巢交界性腫瘤中FoxM1蛋白陽性表達(dá)率為58.82%，其中高表達(dá)的有1 例，占全部卵巢交界性腫瘤組織的5.88%；FoxM1 蛋白在正常卵巢組織中無陽性表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 上皮性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織中FoxM1蛋白表達(dá)情況[例數(shù)（百分率）]

卵巢癌組織中FoxM1蛋白陽性表達(dá)率和高表達(dá)率均顯著高于卵巢交界性腫瘤組織和正常卵巢組織（P＜0.05），卵巢交界性腫瘤組織中FoxM1蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于正常卵巢組織（P＜0.05），分析結(jié)果見表2。

表2 上皮性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織中FoxM1蛋白表達(dá)情況比較

2.2 上皮性卵巢癌組織、卵巢交界性腫瘤及正常卵巢組織中E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)情況

上皮性卵巢癌組織中E-cadherin 和vimentin 蛋白陽性表達(dá)率分別為82.93%和70.73%，其中高表達(dá)分別有22 例和19 例，分別占全部卵巢癌組織53.66%和46.34%。卵巢交界性腫瘤組織中E-cadherin 和vimentin 蛋白陽性表達(dá)率分別為100.00%和41.18%，其中高表達(dá)分別有13例和4例，分別占全部卵巢交界性腫瘤組織的76.47%和23.53%。正常卵巢組織除少許易脫落的表面上皮外，其余大部分為間質(zhì)細(xì)胞，E-cadherin 和vimentin 在間質(zhì)中陽性表達(dá)率分別為25.00%和80.00%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。FoxM1、Ecadherin、vimentin 蛋白在多種卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織中的表達(dá)情況見圖1。

圖1 FoxM1、E-cadherin、vimentin蛋白在多種卵巢上皮性腫瘤及正常卵巢組織中的表達(dá)（×200）

表3 上皮性卵巢腫瘤組織和正常卵巢組織中E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)情況[例數(shù)（百分率）]

2.3 FoxM1蛋白在上皮性卵巢癌組織中表達(dá)的特征

本研究發(fā)現(xiàn)FoxM1蛋白在卵巢透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)具有明顯的異質(zhì)性。在腫瘤的部分區(qū)域呈現(xiàn)低表達(dá)，在腫瘤的部分區(qū)域呈現(xiàn)高表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果見圖2。

圖2 FoxM1蛋白在透明細(xì)胞癌中表達(dá)存在瘤內(nèi)異質(zhì)性

2.4 卵巢癌組織中FoxM1、E-cadherin 和vimentin蛋白表達(dá)情況與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

卵巢癌組織中FoxM1、E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)情況與患者臨床分期（χ2=4.630，P=0.031）、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=6.549，P=0.01）有關(guān)，而與年齡（χ2=1.205，P=0.272）、腫瘤大?。é?=1.101，P=0.294）、有無 脈 管 瘤 栓（χ2=0.176，P=0.675）、組 織 學(xué) 分 型（χ2=4.847，P=0.183）、兩級分級（χ2=1.093，P=0.296）無明顯相關(guān)。臨床分期III～I(xiàn)V 期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者卵巢癌組織中FoxM1、vimentin 蛋白高表達(dá)率分別顯著高于I～I(xiàn)I 期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，而E-cadherin 高表達(dá)率則顯著低于I～I(xiàn)I 期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。分析結(jié)果見表4。

表4 上皮性卵巢癌組織中FoxM1、E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)情況與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.5 上皮性卵巢癌組織中FoxM1、E-cadherin 和vimentin表達(dá)水平的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果如表5 所示，上皮性卵巢癌組織中FOXM1、vimentin 蛋白表達(dá)水平間存在正相關(guān)關(guān)系（φ=0.562，P＜0.05），但二者與E-cadherin蛋白表達(dá)水平間均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（φ值分別為-0.440和-0.366，均為P＜0.05）。

表5 上皮性卵巢癌組織中FoxM1與E-cadherin 和vimentin 蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討 論

上皮性卵巢癌約占全部卵巢癌病例的90%，多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生盆腹腔廣泛散播，造成多數(shù)患者預(yù)后極差，死亡率極高[10]。通過探究上皮性卵巢癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲的分子機(jī)制對于新型藥物研發(fā)以及制定新的治療策略至關(guān)重要。

FoxM1是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，在G0期細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，在G2/M 期呈高水平表達(dá)，并參與了多個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1是一種原癌基因，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，并與患者預(yù)后密切相關(guān)[11]。但FoxM1具體的致癌機(jī)制及其在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌組織中FoxM1蛋白陽性表達(dá)率為97.56%，高表達(dá)率為68.29%，顯著高于正常卵巢組織，提示FoxM1可能參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生。

本次研究進(jìn)一步分析了上皮性卵巢癌組織FoxM1與患者病理指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中FoxM1蛋白表達(dá)情況與患者臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、兩級分級有關(guān)，臨床分期III～I(xiàn)V 期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HGSC 患者卵巢癌組織中FoxM1 蛋白高表達(dá)率分別顯著高于I～I(xiàn)I 期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LGSC 患者，提示FoxM1 與上皮性卵巢癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)，也再次說明FoxM1是上皮性卵巢癌的促癌因子。

本研究發(fā)現(xiàn)FoxM1蛋白在卵巢透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)具有明顯的異質(zhì)性。在腫瘤的部分區(qū)域呈現(xiàn)低表達(dá)，在腫瘤的部分區(qū)域呈現(xiàn)高表達(dá)，此結(jié)果尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

EMT是上皮性卵巢癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、盆腹腔廣泛散播的生物學(xué)基礎(chǔ)之一，EMT能夠使上皮細(xì)胞失去正常的上皮表型、極性，從而獲得間質(zhì)表型和功能，EMT化后的癌細(xì)胞能夠發(fā)生遷移，并和基質(zhì)細(xì)胞相互作用進(jìn)而發(fā)生鄰近組織浸潤，轉(zhuǎn)移至淋巴系統(tǒng)、血液循環(huán)和定植，形成轉(zhuǎn)移病灶[12]。E-cadherin 和vimentin是EMT常用的兩個(gè)生物標(biāo)志物，前者屬于黏附分子鈣依賴性黏附素家族，其表達(dá)水平下調(diào)能夠造成細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞間黏附減少，細(xì)胞活動能力增強(qiáng)，在癌癥中表現(xiàn)為癌細(xì)胞遷移和浸潤能力增強(qiáng)[13]；vimentin是間質(zhì)細(xì)胞中的中間絲蛋白，在細(xì)胞骨架維持中具有重要作用，上皮來源腫瘤細(xì)胞中vimentin 蛋白多呈陰性表達(dá)，間質(zhì)來源腫瘤細(xì)胞則呈陽性表達(dá)，因此vimentin 蛋白在評估腫瘤EMT 化中具有重要的指示價(jià)值[14]。

本研究中，E-cadherin 和vimentin 蛋白在上皮性卵巢癌組織中的高表達(dá)率分別為53.66%和46.34%，有別于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，可能是由于文中樣本量過少，且所選的41例上皮性卵巢癌病例中，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的僅有9 例，占全部上皮性卵巢癌病例數(shù)的21.95%，有78.05%的病例并未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此E-cadherin蛋白顯示出較高的表達(dá)率。

多項(xiàng)研究證實(shí)，F(xiàn)oxM1 與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1 過表達(dá)不僅會促進(jìn)肝細(xì)胞癌的EMT及轉(zhuǎn)移[15]，還可通過靶向細(xì)胞代謝和Snial基因促進(jìn)人胰腺癌細(xì)胞的EMT，從而促進(jìn)人胰腺癌的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展[16]。本研究中上皮性卵巢癌組織E-cadherin 蛋白陽性率和高表達(dá)率低于正常卵巢組織，vimentin 蛋白陽性率和高表達(dá)率高于正常卵巢組織，進(jìn)一步研究則發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中E-cadherin 和vimentin 蛋白表達(dá)情況與患者臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、兩級分級有關(guān)，臨床分期III～I(xiàn)V 期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HGSC 患者卵巢癌組織中E-cadherin 蛋白高表達(dá)率分別顯著低于I～I(xiàn)I 期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LGSC 患者。vimentin 蛋白則表現(xiàn)相反情況，而FoxM1 與E-cadherin 蛋白表達(dá)水平存在顯著負(fù)相關(guān)，與vimentin 蛋白表達(dá)水平之間均存在顯著正相關(guān)性，說明分期較高、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移患者存在EMT，且FoxM1可能通過參與上皮性卵巢癌細(xì)胞的EMT，從而促進(jìn)上皮性卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移。Balli等[17]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1 是肺纖維化EMT 所必需的。FoxM1 能夠結(jié)合并增加Snail1基因的啟動子活性，Snail1基因是EMT 的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。結(jié)合本文結(jié)果，F(xiàn)oxM1 可能通過增強(qiáng)Snail1基因的啟動子活性，從而促進(jìn)腫瘤的EMT過程。此外，Kong等[18]通過多種體外實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)oxM1 的過表達(dá)或敲低可通過激活或抑制AKT/p70S6K 信號傳導(dǎo)途徑，從而改變EMT。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)提示，F(xiàn)oxM1 蛋白的高表達(dá)，可通過激活一系列信號通路，促進(jìn)EMT過程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床進(jìn)展，其中具體的分子機(jī)制，仍需要進(jìn)一步研究。

綜上，F(xiàn)oxM1 蛋白在上皮性卵巢癌組織表達(dá)明顯上調(diào)，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和兩級分級相關(guān)，F(xiàn)oxM1 蛋白促進(jìn)上皮性卵巢癌發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移可能與其促進(jìn)了EMT過程有關(guān)。