姜曉旭，孫慕涵，張渤旭，王鈺越，馬加駿，師敏捷，于衛(wèi)華，，郭 顯

（1．空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院計算機基礎教研室，陜西 西安 710032；2．空軍軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系軍事毒理學教研室，陜西 西安 710032；3．空軍軍醫(yī)大學學員旅，陜西 西安 710032；4．空軍軍醫(yī)大學航空航天醫(yī)學系航空航天醫(yī)學教育部重點實驗室，陜西 西安 710032）

炎癥反應是臨床常見的病理過程，據(jù)統(tǒng)計95%以上的人類疾病發(fā)生均與炎癥相關。炎癥細胞浸潤是感染、膿毒癥、糖尿病和實體性腫瘤等疾病的重要特征，也是關鍵治療靶點[1]。巨噬細胞是機體內(nèi)主要的炎癥效應細胞，全身器官中分布有大量的組織固有巨噬細胞，病理狀態(tài)下血液單核細胞也可被募集到損傷部位轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎鸞2]。巨噬細胞具有極強可塑性，可在不同因子作用下分化為促炎（M1）型和抗炎（M2）型巨噬細胞。白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）等刺激巨噬細胞發(fā)生M2型極化，可分泌大量IL-10等抗炎效應因子，參與調(diào)控機體創(chuàng)傷愈合與炎癥消退[3]。在細菌內(nèi)毒素——脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等刺激下巨噬細胞發(fā)生M1 型極化，釋放大量TNF-α和IL-6等促炎因子，與多數(shù)臨床疾病的發(fā)生密切相關[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)可能在決定巨噬細胞促炎和抗炎分化走向中發(fā)揮重要作用，抑制線粒體損傷和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成可阻斷LPS誘導巨噬細胞M1型極化，改善機體炎癥反應[5]。目前，臨床上常使用的抗炎藥物多為抑制環(huán)氧化酶活性的非甾體抗炎藥，可抑制前列腺素等炎癥介質(zhì)合成，但存在胃腸、肝臟和凝血系統(tǒng)等副作用[6-7]。因此，尋找新型低毒藥物可為臨床炎癥相關疾病的防治提供新思路。

女貞子是木犀科植物女貞的成熟果實，具有滋補肝腎和消炎安神的功效[8]。臨床研究表明，長期服用女貞子可改善心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，降低腫瘤發(fā)生率，延緩機體衰老[9-10]。特女貞苷（nuezhenide，NED）是女貞子的重要活性成分，具有廣泛生物學功效，包括抗炎、降血脂、降血糖、抗疲勞和增強免疫的作用[11-13]。胡冬梅等[11]研究發(fā)現(xiàn)200 mg/kg NED 可顯著改善四氯化碳誘導的急性肝損傷，降低小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和炎癥因子水平。多項研究表明20 μg/mL NED 能夠促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化，并抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞凋亡[12，14-15]。然而，NED抗炎效應的機制目前尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建LPS 誘導巨噬細胞促炎分化模型，重點研究NED對炎癥信號的調(diào)控作用及分子機制，以期為相關炎癥疾病治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

小鼠巨噬細胞系RAW264.7 由空軍軍醫(yī)大學細胞庫提供；NED（純度＞98%，批號39011-92-2）購自成都某生物科技公司。LPS 購自美國Sigma 公司；DCFHDA、Mitotracker-Green（MTG）和JC-1 熒光探針購自美國Invitrogen 公司；小鼠TNF-α和IL-6 ELISA 試劑盒購自武漢華美科技公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione disulfide，GSSG）、CCK-8 和Annexin V/PI 檢測試劑盒均購自上海碧云天生物公司；線粒體酶復合物I 和III 活性檢測試劑盒購自武漢艾美捷生物公司，ATP 含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技公司；核因子NF-E2相關因子2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體購自美國Abcam公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和擴增試劑購自日本TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS等試劑購自美國Gibco公司。

1.2 主要儀器

超凈臺（ESCO，SCV-4A1，新加坡）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo 3111/371，美國）；多功能酶標儀（Infinite M200 PRO，澳大利亞）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus FluoFV10i，日本）；流式細胞儀（BD Accuri C6，美國），實時熒光定量PCR（quantitative real time PCR，qPCR）儀、PCR反轉(zhuǎn)錄儀器（Bio-Rad公司，美國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 RAW264.7細胞培養(yǎng)及分組小鼠巨噬細胞系（RAW264.7）置于含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%恒溫恒濕條件培養(yǎng)。使用100 ng/mL LPS 單獨處理為模型組，100 ng/mL LPS 與NED 低（12.5 μmol/L）、中（25 μmol/L）、高劑量（50 μmol/L）共處理RAW264.7 細胞為干預組，設PBS處理為空白對照組，處理時間均為12 h。

1.3.2 CCK-8 法檢測NED 對RAW264.7 細胞活力的影響以2×104/mL 濃度接種RAW264.7 細胞于96 孔板，給予終濃度為0、12.5、25 和50 μmol/L NED 處理12 h。每孔加入20 μL CCK-8工作液孵育2 h，酶標儀測定吸光度D（450）值，計算細胞活力。

1.3.3 Annexin V/PI 法檢測NED 對RAW264.7 細胞凋亡的影響以1×105/mL 濃度接種RAW264.7 細胞于6 孔板，細胞處于70%～80%匯合度時加入終濃度50 μmol/L NED 或等量PBS，處理12 h 后收集細胞按照說明書使用Annexin V/PI 染色細胞，流式細胞術(shù)檢測凋亡率變化，每組設3個重復樣本。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組學測序分析以1×105/mL 濃度接種RAW264.7細胞于6孔板，50 μmol/L NED 或等量PBS處理12 h 后，采用TRizol 提取細胞RNA。檢測RNA濃度和純度，質(zhì)檢合格后由上海派諾森生物科技有限公司使用Illumina 平臺上機完成轉(zhuǎn)錄組測序（RNAsequencing，RNA-seq）分析，每組設置3 個重復樣本。通過轉(zhuǎn)錄組分析NED處理前后巨噬細胞差異基因，其中熱圖（heatmap）中綠色到紅色漸變，表示基因表達水平逐漸升高。

1.3.5 qPCR 檢測TNF-α和IL-6 mRNA 表達以1×105/mL 濃度接種RAW264.7 細胞于6 孔板，按1.3.1 分組處理12 h 后，使用試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 后應用兩步法進行qPCR，程序設定如下：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，擴增40 個循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，按2-ΔΔCT計算TNF-α和IL-6基因mRNA 相對表達量。引物由上海生工生物公司合成，序列如表1所示。

表1 引物序列信息

1.3.6 ELISA 法檢測TNF-α和IL-6 的分泌分組處理同1.3.1。處理12 h 后，收集細胞上清備用。將TNF-α和IL-6 標準品稀釋成0、1.56、3.12、6.25、12.5、25、50 和100 pg/mL。按照試劑盒說明書加入待測樣品和標準品，37 ℃孵育2 h，清洗后加入檢測工作液，37 ℃孵育30 min。酶標儀測定D（450）值，根據(jù)標準曲線計算細胞上清中TNF-α和IL-6濃度。

1.3.7 DCFH-DA染色法檢測細胞內(nèi)ROS分組處理同1.3.1。處理12 h 后加入終濃度為10 μmol/L 的DCFH-DA 染料，37 ℃避光孵育30 min，PBS 清洗后重懸細胞，流式細胞儀檢測ROS水平變化。

1.3.8 試劑盒檢測GSH、GSSG 含量和SOD、CAT活性分組處理同1.3.1。處理12 h后使用試劑盒按說明書測定GSH和GSSG含量，以及SOD和CAT活性。

1.3.9 免疫熒光檢測Nrf2 表達和亞細胞定位RAW264.7細胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿，50 μmol/L濃度NED 培養(yǎng)12 h 后采用4%多聚甲醛固定30 min，0.1% Triton X-100 通 透10 min，5% BSA 封 閉30 min，加入兔源Nrf2 一抗，37 ℃濕盒孵育過夜。清洗后加入Cy3 標記羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h，加入10 μg/mL 的DAPI 封片，37 ℃染色30 min。PBS 洗滌細胞3 次，激光共聚焦顯微鏡拍照。Cy3（紅色）選擇Ex/Em：548/562 nm；DAPI（藍色）選擇Ex/Em：340/488 nm，分析細胞內(nèi)含量及亞細胞定位。

1.3.10 MTG染色檢測細胞線粒體數(shù)量Mitotracker-Green（MTG）是一種綠色熒光的線粒體特異性染料。細胞分組處理同1.3.1。細胞處理12 h 后加入終濃度為200 nmol/L MTG 染色工作液，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗后流式細胞儀檢測并分析。

1.3.11 JC-1 染色檢測線粒體膜電位JC-1 是一種檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，正常線粒體內(nèi)JC-1以聚合物形式存在呈現(xiàn)紅色熒光；而損傷線粒體中JC-1以單體形式存在，呈現(xiàn)綠色熒光。因此，常用JC-1紅綠熒光強度變化衡量線粒體膜電位水平。分組處理同1.3.1。細胞處理后按照試劑說明進行染色，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光強度，求JC-1紅綠熒光比值。

1.3.12 NADPH 速率法檢測ATP 含量分組處理同1.3.1。通過反復凍融制備細胞勻漿，BCA定量檢測蛋白濃度。依照試劑盒說明書，采用NADPH 速率法加入反應試劑，酶標儀檢測吸光度D（700）值，檢測細胞內(nèi)ATP含量。

1.3.13 比色法檢測線粒體復合物I 和III 活性RAW264.7 細胞處理同1.3.1。該方法不需要提取線粒體，而是基于NADPH 氧化效率變化。比色法檢測吸光度D（340）值和D（550）值，分別反映線粒體復合物I和III的活性。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 NED對RAW264.7細胞活力和凋亡的影響

NED 化學分子式如圖1A 所示。使用不同濃度NED 處理RAW264.7 細胞12 h 后，CCK-8 檢測發(fā)現(xiàn)，NED 刺激未引起細胞活性顯著變化（P＞0.05），結(jié)果見圖1B。Annexin V/PI 染色后流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，50 μmol/L NED處理細胞12 h未引起細胞明顯凋亡和壞死（P＞0.05），結(jié)果見圖1C 和1D。上述結(jié)果提示， 50 μmol/L NED 對巨噬細胞RAW264.7存活和凋亡無明顯影響。

圖1 特女貞苷對RAW264.7細胞活力和凋亡的影響（n=3）

2.2 NED 對RAW264.7 細胞炎癥因子表達和分泌的影響

50 μmol/L NED 處 理RAW264.7 細 胞12 h 后，RNA-seq 結(jié) 果 顯示，NED 處 理抑 制TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎基因表達，并增強IL-4 和IL-10 抗炎基因表達（圖2A）。LPS 是革蘭氏陰性菌細胞壁生物活性成分，常用于誘導巨噬細胞促炎分化。使用100 ng/mL LPS 刺激RAW264.7 細胞12 h 誘導巨噬細胞促炎分化。如圖2B～D 所示，與空白對照組相比，模型組細胞TNF-α和IL-6的mRNA表達和蛋白分泌顯著升高（P＜0.05）。而與模型組比較，100 ng/mL LPS與NED（12.5、25 和50 μmol/L）共處理能夠抑制LPS 誘導的TNF-α和IL-6 升高（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，NED 能夠有效改善LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應。

圖2 特女貞苷阻斷LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應

2.3 NED對細胞ROS、GSH和GSSG的影響

DCFH-DA 是檢測細胞ROS 常用的熒光探針，進入細胞后經(jīng)過水解和氧化轉(zhuǎn)變?yōu)閺姛晒猱a(chǎn)物2',7'-二氯熒光素（DCF）。本文檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組LPS 刺激RAW264.7 細胞后ROS（DCF 熒光）信號增強，表明細胞處于氧化應激狀態(tài)；與模型組比較，12.5、25 和50 μmol/L NED 干預顯著抑制LPS 誘導巨噬細胞的ROS 生成（P＜0.05，圖3A 和B）。不僅如此，與空白對照組比較，模型組LPS 刺激巨噬細胞GSH 含量降低，GSSG 含量增加，表明細胞抗氧化能力減弱（P＜0.05）。而與模型組比較，12.5、25 和50 μmol/L NED 干預可阻斷LPS 誘導的GSH 耗竭，降低GSSG 生成（P＜0.05）（圖3C 和D）。以上結(jié)果證明，NED能夠有效減輕LPS誘導的巨噬細胞氧化應激。

圖3 特女貞苷減輕LPS誘導的RAW264.7細胞氧化應激

2.4 NED對細胞Nrf2及下游抗氧化酶的影響

免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，50 μmol/L NED 處理細胞后Nrf2 熒光信號增強，且發(fā)生明顯核轉(zhuǎn)位（圖4A）。轉(zhuǎn)錄組測序也發(fā)現(xiàn)，NED 干預可促進CAT、SOD1、SOD2、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）和谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate-cysteine ligase，GCLM）等抗氧化酶基因表達增強（圖4B）。與空白對照組相比，模型組LPS 刺激RAW264.7 細胞后CAT 和SOD 活性應激性升高（P＜0.05）；而與模型組比較，12.5、25 和50 μmol/L NED干預后CAT 和SOD 活性進一步增強（P＜0.05）（圖4C 和D）。上述結(jié)果表明，NED通過促進Nrf2表達，從而激活抗氧化系統(tǒng)。

圖4 特女貞苷激活RAW264.7細胞Nrf2抗氧化系統(tǒng)

2.5 NED對細胞線粒體生物合成和功能的影響

轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)， 50 μmol/L NED 處理RAW264.7 細胞12 h 顯著上調(diào)Nrf1、Nrf2、沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關酶1（sirtuin1，STRT1）、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）和過氧化物增殖激活受體協(xié)同激活子（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）等線粒體生物合成相關基因表達（圖5A）。MTG是一種線粒體特異性熒光探針，其水平可反映細胞內(nèi)線粒體含量。如圖5B和C所示，50 μmol/L NED處理細胞后MTG 熒光強度明顯增強，表明線粒體數(shù)量增加（P＜0.05）。模型組LPS 刺激巨噬細胞JC-1 紅綠熒比值減少，表明線粒體膜電位水平下降，加入12.5、25 和50 μmol/L 的NED 干預后，JC-1 紅綠熒光的比值呈現(xiàn)劑量依賴性增加（P＜0.05，圖5D）。此外，LPS 刺激下線粒體復合物I 和III 活性顯著下降，且細胞內(nèi)ATP 含量減少，使用NED 干預可逆轉(zhuǎn)上述過程（P＜0.05）（圖5E～G）。由此可見，NED 能夠刺激線粒體生物合成基因表達升高，增加線粒體數(shù)目，并改善LPS 誘導線粒體代謝功能損傷。

圖5 特女貞苷對RAW264.7細胞線粒體生物合成和代謝功能的影響

3 討 論

隨著人們生活水平提高和環(huán)境污染加劇，感染和非感性炎癥疾病的發(fā)生日益增多[16-18]。巨噬細胞作為機體內(nèi)主要的炎癥效應細胞，可在細菌內(nèi)毒素LPS 作用下發(fā)生促炎分化，釋放大量的TNF-α和IL-6等炎癥因子，既是殺滅病原菌的重要武器，也是導致多數(shù)臨床疾病的基礎[4，19]。大量研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞浸潤激活在膿毒癥、糖尿病、酒精性肝損傷、動脈粥樣硬化等疾病發(fā)生中扮演重要角色[20-21]。因此，靶向巨噬細胞干預已被認為是臨床多種急慢性疾病治療的新方向。本研究以LPS 刺激巨噬細胞促炎反應模型，旨在尋找新的抗炎藥物，以期為臨床炎癥疾病防治提供新的思路。

隨著中藥活性單體分離提取技術(shù)的日趨成熟，人們發(fā)現(xiàn)了一系列具有抗炎和抗氧化特性的中藥成分，如紅景天苷、二苯乙烯苷、姜黃素等[22-23]。女貞子作為傳統(tǒng)中藥代表，具有抗癌、降血糖、降血脂和調(diào)節(jié)免疫等生物學作用[8，10，24-25]。特女貞苷（NED）作為女貞子提純的主要活性成分，由于相關研究較少，目前對其功能認識尚且不足。本研究發(fā)現(xiàn)50 μmol/L NED并不會引起RAW264.7 巨噬細胞活力下降和凋亡發(fā)生，表明其對細胞毒性較小。不僅如此，25、50 μmol/L NED 干預可抑制LPS誘導巨噬細胞促炎因子TNF-α和IL-6 的表達分泌，增強抗炎因子表達。上述結(jié)果提示，NED具有抑制巨噬細胞促炎反應的功能，可能是女貞子發(fā)揮消炎作用的重要機制。

研究表明，氧化還原與炎癥反應之間關系密切，氧化還原失衡是環(huán)境污染導致機體損傷的重要特征[18，26-27]。在環(huán)境不利因素刺激下，巨噬細胞和中性粒細胞發(fā)生浸潤激活，釋放大量炎癥因子和ROS。不僅如此，ROS水平可以決定巨噬細胞促炎和抗炎分化走向，ROS 升高可刺激巨噬細胞向促炎分化，ROS 減少有助于巨噬細胞向抗炎型分化[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，NED 干預處理顯著降低LPS 誘導的RAW264.7 細胞中ROS 和GSSG 水平升高，改善氧化應激。此外，Nrf2是細胞內(nèi)抗氧化體系的核心調(diào)控因子，其入核激活后可促進多種抗氧化因子的轉(zhuǎn)錄表達[30-32]。抑制或敲減Nrf2能夠阻斷巨噬細胞促炎信號激活，使用抗氧化劑激活Nrf2 可減輕多種因素誘導機體炎癥反應[33-34]。本研究證實，NED 刺激下RAW264.7 細胞中Nrf2 發(fā)生明顯入核現(xiàn)象，并激活下游CAT、SOD、HO-1、GCLM等抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄表達，增加細胞內(nèi)GSH含量。可見，NED激活Nrf2及下游抗氧化系統(tǒng)，通過改善氧化還原平衡抑制LPS誘導巨噬細胞促炎反應。

線粒體是細胞內(nèi)能量合成和ROS 生成的主要場所，線粒體穩(wěn)態(tài)對于維持細胞增殖、分化、凋亡和衰老具有重要意義[35-37]。線粒體生物合成是維持機體細胞線粒體新生和穩(wěn)態(tài)的關鍵機制，主要受到PGC1-α、TFAM 和NRF1 等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，激活細胞核以及線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄表達，進而增強線粒體復合物的合成。研究表明，線粒體生物合成增強可抑制多種因素誘導的細胞凋亡，阻斷LPS 誘導巨噬細胞促炎分化[38]。中藥何首烏提取物二苯乙烯苷可通過激活HO-1 介導線粒體生物合成抑制巨噬細胞促炎因子分泌[24]。褪黑素可通過激活線粒體生物合成抑制心肌細胞凋亡，改善糖尿病心肌病[39]。本文轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，NED 能夠促進線粒體生物合成相關基因SIRT1、PGC1-α、TFAM和NRF1的 表 達。MTG 和JC-1染色發(fā)現(xiàn)，NED干預處理后巨噬細胞線粒體數(shù)量增加，并抑制LPS 誘導線粒體膜電位的降低。既往研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激巨噬細胞發(fā)生糖代謝重編程，主要代謝方式由線粒體依賴的氧化磷酸化代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷€粒體依賴的糖酵解代謝，而改善線粒體代謝可阻斷LPS誘導巨噬細胞促炎信號激活[5，40-41]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)NED 逆轉(zhuǎn)了LPS 誘導的細胞線粒體復合物I 和III活性降低，增強ATP合成，提示線粒體代謝功能顯著改善。因此，NED可能通過增強線粒體生物合成改善其結(jié)構(gòu)和功能，進而抑制LPS 誘導的巨噬細胞促炎反應。

綜上所述，NED 作為傳統(tǒng)中藥女貞子的活性單體，具有較強的抗炎和抗氧化功效，可能通過抑制巨噬細胞促炎分化發(fā)揮機體抗炎效應，具有作為抗炎癥相關疾病治療候選藥物的潛力。