李祥欣 陳笛 孫軍 汪寧 溫昌明 張保朝

(南陽市中心醫(yī)院,河南 南陽 473000)

癲癇以反復(fù)自發(fā)性發(fā)作為特征,影響著全世界超過6 500萬人〔1,2〕。雖然抗癲癇藥物被認(rèn)為是最基本的治療方法,但經(jīng)過最佳藥物治療后,仍有部分患者癲癇發(fā)作〔3〕。此外,目前使用的抗癲癇藥物只控制癲癇發(fā)作,對導(dǎo)致癲癇的病理變化沒有影響,也不能阻斷癲癇的過程。因此,尋找有效的措施防治癲癇仍然是研究熱點。在臨床試驗和動物實驗中,證據(jù)表明,神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激在癲癇發(fā)作機制中起重要作用,豨薟草是一種常用中藥,最早記載于《新修本草》,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),豨薟草中含有黃酮類成分,具有抗炎、抗氧化、抗菌等生物學(xué)活性〔4〕。已有報道稱幾種黃酮類化合物可通過增加環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)/腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)通路的磷酸化水平來改善神經(jīng)功能〔5〕。但目前為止,尚未見有關(guān)于豨薟草對癲癇的治療作用。因此,本研究擬通過構(gòu)建癲癇大鼠模型,探究豨薟草總黃酮對癲癇的藥效作用及對CREB/BDNF信號通路的作用機制。

1 材料及方法

1.1動物 SPF級SD雄性大鼠,體質(zhì)量180～220 g,購自鄭州大學(xué),許可證號:SCXK(鄭)2017-0001。大鼠自由采食飲水,室溫維持在22～25 ℃,相對濕度50%～70%。本研究經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn),并遵循醫(yī)院相關(guān)協(xié)議進(jìn)行,根據(jù)國家科技部批準(zhǔn)發(fā)布的“實驗動物保護(hù)和使用指導(dǎo)意見”進(jìn)行。

1.2主要試劑及儀器 白細(xì)胞介素(IL)-6試劑盒(H007)、IL-1β試劑盒(H002)、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(H052)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(A003)、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(A001)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(A005)均購自南京建成生物工程研究所。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S)、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1091)均購自上海碧云天生物科技有限公司。重組Anti-CREB抗體(ab32515)、重組Anti-CREB(phospho S133)抗體(ab32096)、重組Anti-BDNF抗體(ab108319)均購自美國Abcam公司。酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司,光學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司,蛋白電泳儀購自北京六一儀器廠,凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3動物模型制備 按照文獻(xiàn)〔6〕的方法,在大鼠體內(nèi)建立了鋰-毛果蕓香堿誘發(fā)的癲癇模型。首先,大鼠腹腔注射127 mg/kg氯化鋰。24 h后,腹腔注射阿托品1 mg/kg以抑制膽堿能效應(yīng)。腹腔注射35 mg/kg毛果蕓香堿誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)。監(jiān)測大鼠的SE發(fā)作情況,排除SE持續(xù)不明顯的動物,因為持續(xù)至少1 h的SE是自發(fā)性癲癇反復(fù)發(fā)作的先決條件。注射后15～60 min內(nèi)出現(xiàn)SE,典型癥狀包括持續(xù)的運動性肢體癲癇發(fā)作,并伴有間歇性站立和摔倒,偶爾還會出現(xiàn)狂野奔跑。SE持續(xù)1 h后,肌肉注射地西泮4 mg/kg即可停止癲癇發(fā)作。如果地西泮不起作用,則再注射腹腔注射3 ml/kg水合氯醛。若根據(jù)Racine評分〔7〕評估大鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度達(dá)到了Ⅳ或Ⅴ級,表明SE模型構(gòu)建成功。對照組大鼠以生理鹽水代替氯化鋰及匹羅卡品進(jìn)行腹腔注射。

1.4動物分組及樣本采集 將造模成功的SE大鼠分成模型組、豨薟草總黃酮低劑量組、豨薟草總黃酮中劑量組和豨薟草總黃酮高劑量組,每組12只。再另取12只大鼠作對照組處理。分別給予豨薟草總黃酮低、中、高劑量組5、10、20 mg/kg的劑量灌胃治療,1次/d,連續(xù)4 w。對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.5行為學(xué)觀察 末次給藥結(jié)束后24 h,根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠行為學(xué)進(jìn)行評估。Ⅰ級為面肌痙攣和獨立肌陣攣,Ⅱ級為全身性肌陣攣,Ⅲ級為全身性強直性肌陣攣,Ⅳ級為反復(fù)全身性強直性肌陣攣或驚厥至死亡,Ⅴ級是指相關(guān)的肌陣攣或與死亡有關(guān)。

1.6樣本采集 行為學(xué)觀察結(jié)束后,用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。然后將大鼠仰臥位固定,打開胸腔暴露心臟。注射器通過左心室插入升主動脈。切開右心耳,在2 min內(nèi)灌注150 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)后,即刻開顱取腦,分離海馬組織,左側(cè)海馬組織放于4%多聚甲醛中固定,右側(cè)海馬組織液氮速凍保存。

1.7炎癥因子的檢測 取液氮速凍的海馬組織,研磨勻漿化,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測海馬組織中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.8氧化應(yīng)激評估 利用ELISA試劑盒對海馬組織中MDA、SOD和GSH-Px水平進(jìn)行檢測。

1.9分析海馬組織病理變化 將海馬組織在4%多聚甲醛固定24 h后,脫水透明,石蠟包埋,切成厚度為4 μm切片。HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織神經(jīng)元的病理變化。

1.10海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測 利用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測大鼠海馬組織中的細(xì)胞凋亡情況。將組織切片常規(guī)脫蠟水化,TUNEL反應(yīng)混合液孵育及染色處理,于顯微鏡下觀察每只大鼠的2張切片。并隨機選擇每張切片各5個區(qū)域,計算每單位面積的TUNEL染色細(xì)胞數(shù)(核染深褐色陽性細(xì)胞),細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.11大鼠海馬組織中CREB、BDNF蛋白表達(dá)水平測定 用蛋白提取試劑盒提取海馬組織勻漿中的總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白含量。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白,然后將分離蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用5%脫脂奶粉封閉2 h。加CREB、p-CREB、BDNF一抗(稀釋倍數(shù)為1∶1 000),于4 ℃下過夜孵育,洗膜后加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶200)室溫孵育1 h,再次洗膜。用化學(xué)發(fā)光試劑顯影,凝膠成像儀觀察,ImageJ分析軟件對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度值分析。以β-actin為內(nèi)參蛋白,分析蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

1.12統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1豨薟草總黃酮對SE大鼠行為學(xué)的影響 與對照組相比,模型組行為學(xué)評分顯著升高(P<0.05);與模型組相比,豨薟草總黃酮各劑量組行為學(xué)評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組行為學(xué)評分及海馬組織炎癥因子水平比較

2.2豨薟草總黃酮對海馬組織炎癥因子水平的影響 與對照組相比,模型組IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,豨薟草總黃酮各劑量組IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3豨薟草總黃酮對海馬組織氧化應(yīng)激的影響 與對照組相比,模型組MDA水平顯著升高(P<0.05),SOD和GSH-Px水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,豨薟草總黃酮各劑量組MDA水平顯著降低(P<0.05),SOD和GSH-Px水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組海馬組織氧化應(yīng)激及神經(jīng)元凋亡、海馬組織中p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)水平比較

2.4豨薟草總黃酮對海馬組織病理變化的影響 對照組有大量致密的錐體細(xì)胞排列,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、完整、正常,邊緣清晰,染色質(zhì)分布均勻,胞質(zhì)內(nèi)有豐富的尼氏小體。模型組神經(jīng)元損傷明顯,部分神經(jīng)元丟失,細(xì)胞排列紊亂,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不完整,胞質(zhì)、胞核縮小,尼氏小體減少。豨薟草各劑量組神經(jīng)元損傷減輕,高劑量組尤為明顯。見圖1。

圖1 各組海馬組織病理(HE染色,×200)

2.5豨薟草總黃酮對海馬神經(jīng)元凋亡的影響 與對照組相比,模型組神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05);與模型組相比,豨薟草總黃酮各劑量組神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組海馬神經(jīng)元(TUNEL染色,×400)

2.6豨薟草總黃酮對海馬組織中CREB、BDNF蛋白表達(dá)水平的影響 與對照組相比,模型組CREB蛋白的磷酸化水平顯著降低(P<0.05);BDNF蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,豨薟草總黃酮各劑量組p-CREB和BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。見表2、圖3。

1～5:對照組、模型組、豨薟草總黃酮低、中、高劑量組圖3 Western印跡檢測各組CREB、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)

3 討 論

癲癇是一種以反復(fù)無故發(fā)作為特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,由腦神經(jīng)元過度刺激和超同步性引起〔8〕。SE主要以長時間癲癇活動或頻繁發(fā)作而不能回到基線狀態(tài)為特征〔9〕。反復(fù)癲癇發(fā)作可能導(dǎo)致一系列后遺癥,如記憶障礙、生活質(zhì)量下降和意外死亡〔10〕。盡管在過去幾年中癲癇治療有許多進(jìn)展,所有癲癇病例中仍有近30%的病例對藥物無效,即使在給予最佳藥物治療后癲癇仍持續(xù)發(fā)作。因此,開發(fā)新的癲癇治療方法非常重要。

豨薟草作為一種傳統(tǒng)中藥,可以治療風(fēng)濕痹痛、四肢麻痹、半身不遂、筋骨無力等癥狀〔11〕。黃酮類化合物是豨薟草中的一種有效成分,可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),抑制氧化應(yīng)激。本研究利用鋰-毛果蕓香堿誘發(fā)大鼠SE模型。鋰-毛果蕓香堿誘發(fā)的癲癇大鼠模型的行為和病理特征與人為誘發(fā)的損傷相似,例如缺氧、SE、腦外傷、腦卒中、腫瘤或高熱性癲癇發(fā)作,然后在一段時間的沉默后出現(xiàn)自發(fā)性反復(fù)癲癇發(fā)作〔12〕。癲癇發(fā)作會導(dǎo)致海馬組織受到嚴(yán)重?fù)p害,神經(jīng)元死亡最終是由一系列細(xì)胞死亡級聯(lián)引起的,這些級聯(lián)涉及過度的炎癥、神經(jīng)膠質(zhì)活化、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等〔13〕。本研究表明,豨薟草總黃酮對SE大鼠的神經(jīng)元損傷具有明顯的保護(hù)作用。

反復(fù)癲癇發(fā)作過程中活性氧(ROS)生成增加會引起氧化損傷,甚至導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷。MDA是氧化應(yīng)激的關(guān)鍵標(biāo)志,在多不飽和脂質(zhì)的氧化降解過程中產(chǎn)生。ROS誘導(dǎo)MDA的產(chǎn)生,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)毒性和細(xì)胞死亡〔14〕。而SOD是一種抗氧化酶,GSH是一種有效的自由基和活性氧清除劑,SOD和GSH水平降低與氧化應(yīng)激水平增加相關(guān)〔15〕。本研究表明,SE的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),且豨薟草總黃酮可調(diào)節(jié)SE大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。毛果蕓香堿引起的癲癇發(fā)作觸發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)活化并促進(jìn)各種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,從而引發(fā)海馬內(nèi)的一系列炎癥過程。促炎分子的釋放會破壞神經(jīng)膠質(zhì)的正常生理功能,從而影響神經(jīng)功能。本研究表明,豨薟草總黃酮可抑制SE大鼠的神經(jīng)炎癥。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,CREB可激活長時間活動依賴性突觸可塑性所需的信號級聯(lián)及對ROS介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)。CREB以磷酸化形式被激活,作用于DNA,促進(jìn)BDNF蛋白產(chǎn)生〔16〕。BDNF蛋白是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,可促進(jìn)神經(jīng)分化、存活和神經(jīng)再生。癲癇發(fā)作后大腦神經(jīng)元死亡〔17〕,會啟動炎癥反應(yīng)以恢復(fù)組織穩(wěn)態(tài)并清除死細(xì)胞,而BDNF具有抵消各種炎癥細(xì)胞因子的抗炎作用〔18〕。在毛果蕓香堿誘導(dǎo)癲癇發(fā)作后,BDNF會增加被認(rèn)為是大腦的一種防御機制,以防止神經(jīng)元退化。然而,這種機制不足以保護(hù)神經(jīng)元損傷。本研究表明,CREB激活引起B(yǎng)DNF上調(diào),保護(hù)大腦免受癲癇損傷。

綜上,豨薟草總黃酮可通過激活CREB/BDNF信號通路,抑制神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激,減少神經(jīng)元凋亡,從而保護(hù)SE大鼠海馬神經(jīng)組織。因此本文推測豨薟草總黃酮可能成為治療癲癇的一種新藥物,然而,關(guān)于豨薟草總黃酮對SE大鼠的其他作用機制仍有待進(jìn)一步研究。