章志學(xué) 王英 謝將 曾俊權(quán) 肖祎

(1吉安市中心人民醫(yī)院,江西 吉安 343000;井岡山大學(xué) 2臨床醫(yī)學(xué)院;3數(shù)理學(xué)院)

由于造血干細(xì)胞的異常增殖,無(wú)法進(jìn)行正常的分化凋亡等機(jī)制,造血組織內(nèi)積累大量的異常分化細(xì)胞,進(jìn)一步會(huì)浸潤(rùn)其他正常組織及器官,對(duì)機(jī)體正常的造血功能造成阻礙,從而導(dǎo)致了白血病的發(fā)生〔1〕。白血病是一種發(fā)生于血液系統(tǒng)的惡性腫瘤〔2,3〕,對(duì)人類生命健康安全造成了極大的威脅。目前臨床對(duì)于白血病的治療多采用阿糖胞苷、三氧化二砷、柔紅霉素等化療藥物,但此類藥物作用時(shí)往往缺乏特異性靶點(diǎn),導(dǎo)致正常組織在治療過(guò)程中受損,引起一系列不良反應(yīng),對(duì)患者造成極大的痛苦〔4〕,同時(shí)機(jī)體對(duì)化療藥物產(chǎn)生的耐藥性也是白血病治療的一大難點(diǎn)〔5,6〕,因此尋找更有效的抗白血病藥物勢(shì)在必行。當(dāng)自然界植物遭受刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生一種多酚類抗毒素,即白藜蘆醇,普遍存在于葡萄、虎杖、花生等植物中,研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇具有消炎、抗菌、抗氧化、抑制腫瘤活性等多種藥理作用〔7～9〕,白藜蘆醇對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖等過(guò)程存在顯著影響〔10,11〕,由此推測(cè)白藜蘆醇可能對(duì)白血病存在治療作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是控制能量代謝的重要因子,通過(guò)協(xié)調(diào)機(jī)體內(nèi)部的多條代謝通路,以保持能量的平衡,AMPK/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路是參與能量代謝的一條重要通路,同時(shí)也是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的重要通路,本研究探討白藜蘆醇通過(guò)AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)白血病細(xì)胞自噬及凋亡的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 白血病K562細(xì)胞系由中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供,將細(xì)胞放置在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至傳代,取對(duì)數(shù)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器 白藜蘆醇(純度98%,廠家為西安格林生物科技有限公司);二甲基亞砜(DMSO,貨號(hào)D2650,廠家為美國(guó)Sigma公司);噻唑藍(lán)(MTT)試劑(貨號(hào)M2128,廠家為美國(guó)Sigma公司);吉姆薩染色液(貨號(hào)R20653,廠家為上海源葉生物科技有限公司);吖啶橙染色液(貨號(hào)GL0329,廠家為北京百奧萊博科技有限公司);抗體p-AMPK(貨號(hào)ab133448)、抗體p-mROR(貨號(hào)ab109268)、抗體微管相關(guān)蛋白(LC3B;貨號(hào)ab192890)、抗體半胱氨酸天冬酶(Caspase)-3(貨號(hào)ab32351)、IgG二抗(貨號(hào)ab150077)廠家均是英國(guó)Abcam公司;Cell Meter細(xì)胞自噬檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)AAT-B23002,廠家為上海齊源生物科技有限公司);膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)40302ES20,廠家為上海翊圣生物科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(貨號(hào)AR016,廠家為武漢博士德生物工程有限公司);XDS-900C型光學(xué)顯微鏡(廠家為上海蔡康光學(xué)儀器廠);CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(廠家為美國(guó)Beckman公司)。

1.3細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞分為對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇高劑量組(白藜蘆醇濃度分別為0、100、200 μmol/L〔12〕),接種于96孔板,加入相應(yīng)濃度的白藜蘆醇處理1、3、6、12、24、48 h。向每孔滴加20 μl 5 mg/ml的MTT溶液,遮光培養(yǎng)4 h后吸取上清液并倒入200 μl DMSO溶液,進(jìn)行充分振蕩溶解,記錄490 nm處細(xì)胞吸光值A(chǔ),并得出細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-白藜蘆醇處理組細(xì)胞A值/未處理組細(xì)胞A值)×100%,共進(jìn)行3次。

1.4細(xì)胞形態(tài)觀察 采用吉姆薩染色法觀察細(xì)胞形態(tài),取經(jīng)相應(yīng)濃度白藜蘆醇處理24 h的白血病細(xì)胞,制成涂片并用甲醇進(jìn)行固定,滴加吉姆薩染色液染色15 min,吸取剩余的染色液并將其洗凈,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5細(xì)胞凋亡能力檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,將對(duì)數(shù)期分別接種于6孔板中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入相應(yīng)濃度的白藜蘆醇繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使用冰箱內(nèi)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈,根據(jù)試劑盒步驟說(shuō)明進(jìn)行操作,用流式細(xì)胞儀記錄凋亡率,共進(jìn)行3次。

1.6細(xì)胞自噬能力檢測(cè) 采用吖啶橙染色法觀察細(xì)胞自噬,取經(jīng)相應(yīng)濃度白藜蘆醇處理24 h的白血病細(xì)胞,制成涂片并用甲醇進(jìn)行固定,加入1 mg/L的吖啶橙染色液遮光染色20 min,吸取染色液并將其洗凈,顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬率,將對(duì)數(shù)期分別接種于6孔板中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入相應(yīng)濃度的白藜蘆醇繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使用冰箱內(nèi)預(yù)冷的PBS洗凈,根據(jù)試劑盒步驟說(shuō)明進(jìn)行操作,用流式細(xì)胞儀記錄自噬率(%),共進(jìn)行3次。

1.7細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western印跡,將對(duì)數(shù)期細(xì)胞分別接種于6孔板中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入相應(yīng)濃度的白藜蘆醇繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入蛋白裂解液提取總蛋白,在12 000 r/min條件下離心10 min得上部液體,采用BCA試劑盒檢測(cè)其濃度,各組取該樣品約30 μg進(jìn)行電泳,蛋白分離后進(jìn)行轉(zhuǎn)移,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,放入經(jīng)稀釋的一抗(1∶1 000),在4 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)至第2天,用PBS洗凈后放入經(jīng)稀釋的二抗(1∶5 000),室溫半小時(shí)再次用PBS洗凈,顯色顯影后進(jìn)行計(jì)算,共進(jìn)行3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞增殖能力比較 如表1所示,相較于對(duì)照組,經(jīng)不同濃度白藜蘆醇處理后的白血病細(xì)胞增殖抑制率均呈不同程度升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中高劑量白藜蘆醇作用效果更明顯,且隨藥物作用時(shí)間的增加其增殖抑制作用更明顯。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2各組細(xì)胞形態(tài)比較 如圖1所示,對(duì)照組白血病細(xì)胞細(xì)胞核大小均一,形態(tài)結(jié)構(gòu)完整;白藜蘆醇低劑量組白血病細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)不同程度皺縮,部分細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)破裂,出現(xiàn)存在凋亡小體的凋亡細(xì)胞;白藜蘆醇高劑量組白血病細(xì)胞中凋亡細(xì)胞及破裂細(xì)胞數(shù)大量增加。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)比較(吉姆薩染色,×400)

2.3各組細(xì)胞凋亡能力比較 如表2、圖2所示,相較于對(duì)照組,經(jīng)不同濃度白藜蘆醇處理后的白血病細(xì)胞凋亡率均呈不同程度升高,其中高劑量白藜蘆醇作用效果更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率比較

表2 各組細(xì)胞凋亡率、自噬率及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.4各組細(xì)胞自噬能力比較 如圖3所示,綠色細(xì)胞為正常細(xì)胞,橙色細(xì)胞為自噬細(xì)胞,對(duì)照組白血病細(xì)胞均為正常細(xì)胞,均未發(fā)生自噬;白藜蘆醇低劑量組白血病細(xì)胞部分發(fā)生自噬,可在部分細(xì)胞內(nèi)觀察到明顯的自噬小泡;白藜蘆醇低劑量組白血病細(xì)胞內(nèi)含自噬小泡的自噬細(xì)胞數(shù)量大量增加。如表2所示,相較于對(duì)照組白血病細(xì)胞,經(jīng)不同濃度白藜蘆醇處理后的白血病細(xì)胞自噬率均呈不同程度升高,其中高劑量白藜蘆醇作用效果更明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 各組細(xì)胞自噬能力(吖啶橙染色,×400)

2.5各組細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)比較 如表2、圖4所示,相較于對(duì)照組白血病細(xì)胞,經(jīng)不同濃度白藜蘆醇處理后的白血病細(xì)胞內(nèi)p-AMPK、LC3B蛋白表達(dá)呈不同程度升高,而p-mTOR、Caspase-3含量呈不同程度降低,其中高劑量白藜蘆醇作用效果更明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1～3:對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇高劑量組圖4 Western印跡檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

白血病作為一種極其惡性的造血系統(tǒng)疾病〔13〕,對(duì)于白血病的治療臨床多采用藥物化療的方法,其中大部分年輕患者癥狀會(huì)逐步緩解,但預(yù)后效果普遍較差,白血病患者的5年生存率仍低于40%〔14〕,且目前廣泛使用的化療藥物不良反應(yīng)明顯,治療往往伴隨嘔吐、出血、感染等癥狀〔4〕,對(duì)患者的身心帶來(lái)雙重傷害。中醫(yī)是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),主張辨證論治、整體觀念,研究發(fā)現(xiàn),中藥在腫瘤治療方面有很好的應(yīng)用,一方面是因?yàn)槠鋵?duì)腫瘤細(xì)胞明顯的抑制作用,另一方面其作為天然化學(xué)藥物具有毒副作用小的優(yōu)勢(shì),中醫(yī)藥對(duì)腫瘤治療有巨大的研究?jī)r(jià)值。

白藜蘆醇是一種多酚類抗毒素,一般在植物收到紫外線、機(jī)械損傷、病毒感染等刺激時(shí)產(chǎn)生,白藜蘆醇是研究發(fā)現(xiàn)的一種新型抗癌藥物,對(duì)白血病也具有一定的治療作用〔15〕,另外將白藜蘆醇與化療藥物聯(lián)用時(shí)能明顯降低化療藥物的不良反應(yīng)〔16〕。由于中藥本身不是單一的化合物,其作用機(jī)制具有多通路、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),所以對(duì)于中藥作用機(jī)制的研究也是科學(xué)研究的一大難點(diǎn)。馬麗君等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞具有明顯的體外抑制作用,且對(duì)其細(xì)胞凋亡產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用,并推測(cè)其作用機(jī)制與下調(diào)C-myc癌基因及蛋白的表達(dá)有關(guān);Yan等〔17〕則提出白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞的抑制作用與誘導(dǎo)其細(xì)胞分化有關(guān),其中向紅系分化較明顯。細(xì)胞自噬異常常與腫瘤的發(fā)展過(guò)程密切相關(guān),腫瘤細(xì)胞需要通過(guò)細(xì)胞自噬維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,而過(guò)度的細(xì)胞自噬會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡,也就是細(xì)胞凋亡過(guò)程,所以細(xì)胞自噬及凋亡在腫瘤細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。李傳翠等〔18〕指出,AMPK/mTOR可能影響白血病的發(fā)展進(jìn)程。

本研究結(jié)果提示,白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞能夠產(chǎn)生明顯的體外抑制作用,不同濃度的白藜蘆醇處理的白血病細(xì)胞的增殖抑制率均顯著增加,其中高濃度白藜蘆醇的抑制作用明顯高于低濃度,且隨著白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞處理時(shí)間的增長(zhǎng)其抑制效果會(huì)逐步增強(qiáng),與之前的研究結(jié)果相吻合,進(jìn)一步證實(shí)了白藜蘆醇對(duì)白血病的治療作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞的抑制作用與其促進(jìn)細(xì)胞自噬及凋亡有關(guān),經(jīng)白藜蘆醇處理后的白血病細(xì)胞自噬及凋亡水平均有所增強(qiáng),且高濃度白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞自噬及凋亡兩個(gè)生理過(guò)程產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用更明顯。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)其可能作用機(jī)制與AMPK/mTOR通路存在密切聯(lián)系。本研究結(jié)果提示,白藜蘆醇能夠激活白細(xì)胞內(nèi)的AMPK/mTOR通路,進(jìn)而促進(jìn)其下游通路LC3B等自噬蛋白的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞自噬過(guò)程,過(guò)度自噬激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase系統(tǒng),加速Caspase-3對(duì)凋亡細(xì)胞的切割過(guò)程,從而加速其細(xì)胞的凋亡,那么白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞的治療作用可能就是通過(guò)該條通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上,白藜蘆醇對(duì)白血病細(xì)胞自噬及凋亡過(guò)程具有明顯的促進(jìn)作用,其具體作用過(guò)程與AMPK/mTOR密切相關(guān),未來(lái)還需通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證及深入研究,并且由于中藥單藥有效成分的復(fù)雜性,白藜蘆醇體對(duì)白血病細(xì)胞的體外抑制作用可能涉及多條通路,未來(lái)還需深入研究。