呂昀徽 王碩 王小康 鄭曉冰 陳皓生 王欣 崔永春

1 超聲造影劑的分類及其特點

超聲造影劑是在超聲成像中用來增強圖像對比度的物質(zhì)。一般為微米量級直徑的包膜微氣泡，核心成分多采用高分子量、低血液溶解度和低彌散度的氟碳氣體[1]。根據(jù)超聲造影劑囊膜成分將其分為脂質(zhì)微泡、蛋白質(zhì)微泡、聚合物微泡（PLGA）和表面活性劑微泡四類。

脂質(zhì)體造影劑的殼膜分二棕櫚酰磷酯酰膽堿（DPPC）和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）兩種。這類磷脂脂肪鏈長，高度飽和，柔韌性較強，在血液中壽命較長，脂類作為微泡的殼膜，雖不如高分子多聚物穩(wěn)定，但其聲學(xué)響應(yīng)性好，形成的微泡易產(chǎn)生回波[2]。

第二類為蛋白質(zhì)殼膜，這種殼膜以白蛋白為主，目前也常用溶菌酶、親和素等生物活性蛋白。蛋白類造影劑穩(wěn)定性較好、無毒、易制備。但其價格昂貴、熱穩(wěn)定性差。且該類造影劑內(nèi)部氣體與人血白蛋白混合后，容易引起過敏反應(yīng)，嚴重會引起血壓下降、休克，從而限制了其應(yīng)用范圍[2]。

此外，還有一些由乳酸-羥基乙酸共聚物、海藻酸鹽、多聚糖等高分子材料通過其內(nèi)部含有的高分子鏈的交聯(lián)及交織作用構(gòu)造而成的造影劑[3-4]，這種造影劑生物相容性高，無毒性作用，可生物降解。并且擁有厚且機械強度高的聚合物外殼，這使得高分子材料造影劑在氣體交換時不易坍塌，非常穩(wěn)定，在水介質(zhì)中可以儲存數(shù)周。但因成像需較高的聲學(xué)輸出引起微泡的非線性振動，如毛細血管破裂、肺出血等[5]。

近期，有研究使用脂類、聚合物類、蛋白質(zhì)氨基酸類等制作表面活性薄膜造影劑，表面活性物質(zhì)既可減慢氣體溶解，也可增加微泡的穩(wěn)定性，其不足之處在于存放時間短且不宜包裹分子量小的氣體。

新一代的超聲造影劑應(yīng)具有如下特點：（1）高安全性、低副作用，有明確的破壞閾值，有可預(yù)測性及可重復(fù)性，最終可降解或被較快地排出體外；（2）微泡大小均勻，足夠小，小于紅細胞的直徑（7 μm），確保能通過肺毛細血管，進入動脈循環(huán)，達到造影效果而不會造成栓塞；（3）具有很強的散射特性，能產(chǎn)生豐富的諧波；（4）穩(wěn)定性好，在血液內(nèi)保留的時間允許超聲成像顯示其在組織內(nèi)的灌注（增強）和廓清（消退）過程；（5）易于生產(chǎn)，便于儲存，價格適宜。但是這種超聲造影劑缺乏靶向性，不能長期停留在靶組織或靶器官中，導(dǎo)致在病變組織的血管顯影中的停留時間較短，難以準確地診斷疾病。因此，人們研發(fā)出第三代靶向超聲造影劑，通過微泡表面連接的特異性配體或抗體，與靶組織或靶器官相應(yīng)的受體相結(jié)合從而實現(xiàn)靶向定位診斷或治療，這已成為超聲領(lǐng)域研究的熱點[6]。

2 靶向超聲造影劑

靶向超聲造影劑大致結(jié)構(gòu)如圖1 所示。由三個基本結(jié)構(gòu)單位構(gòu)成：（1）以脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、高分子多聚物或表面活性劑為主構(gòu)成的殼膜；（2）內(nèi)部填充一些氟碳氣體；（3）外膜覆以特異性配體（多為抗體、多肽等）。靶向使超聲造影微泡能夠特異性結(jié)合并聚集于病灶部位，停留時間長；氟碳氣體在水和血液中的溶解度較低，使其在血液中壽命較長，這些優(yōu)點使靶向微泡聚集于目標組織或器官，降低生物毒性。還可實現(xiàn)藥物定點釋放、體內(nèi)運輸以及基因轉(zhuǎn)染，增加局部濃度，減少其在非靶組織內(nèi)聚集的毒性不良反應(yīng)。

圖1 靶向超聲造影劑的結(jié)構(gòu)示意圖

制造靶向造影劑的關(guān)鍵步驟是將配體連于微泡表面，使其具有特異性結(jié)合靶器官或靶組織的能力。因此，選擇合適的靶向配體是制備靶向性高、結(jié)合力強的靶向超聲造影劑的關(guān)鍵。理想的配體應(yīng)具備以下條件：（1） 高表達特異性；（2）高分泌性；（3）非免疫源性； （4）注入體內(nèi)后高度穩(wěn)定性；（5）高度耐受血流切應(yīng)力等。

根據(jù)不同疾病表達的受體的特異性，選擇的配體也各不相同。目前，國內(nèi)外對不同心血管疾病特異性表達的受體均有所研究（表1）：

表1 不同疾病的靶點及配體

（1）動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、移植排斥反應(yīng)等引起的炎癥中，E-選擇素、P-選擇素、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管內(nèi)皮細胞黏附分子-1（VCAM-1）、連接黏附分子-A（JAM-A）[7-10]均可作為靶點，而配體多為抗上述靶點的單克隆抗體、寡糖基團、線性肽及糖蛋白等[11-13]。

（2）對于血栓而言，多肽是主要的配體，將一些5～10 個氨基酸的小片段多肽制備成靶向造影劑可以有很高的靶向特異性和很強的結(jié)合力。以往的配體多采用RGD（Arg-Gly-Asp）多肽，作為識別活化血小板的配體[14]，近年有研究發(fā)現(xiàn)，用賴氨酸代替精氨酸，能夠明顯增強對活化血小板糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa 受體親和性[10]，KGD（Lys-Gly-Asp）氨基酸序列的肽段由于其僅作用于活化血小板GP Ⅱb/Ⅲa 受體，不會引起或干擾其他細胞類型介導(dǎo)的正常生理活動，是目前相對理想的血栓靶向造影劑配體[15-17]。纖維蛋白是血栓的主要成分，纖維蛋白可以作為微泡的特異性靶區(qū)，氨基酸序列為Cys-Arg-Glu-Lys-Ala（CREKA）的短肽是一種對纖維蛋白有高親和力的多肽，穩(wěn)定性強，藥物富集率高，而將CREKA 里面的Glu 替換為Byn-Methy-Glu氨基酸序列，可以提高多肽抗水解能力[18-19]。

（3）對于新生血管，其靶點主要是整合素α5β1、整合素αVβ3、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和細胞黏附分子CD15 等分子，而配體主要是含RGD 氨基酸序列的寡肽或單克隆抗體等[20-21]，BR55（bracco diagnostics）是目前唯一進入臨床試驗的分子靶向造影劑，其靶點是VEGF 受體-2（VEGFR-2）[22]。

配體與微泡表面連接方法有兩類。第一類為共價連接法，包括直接結(jié)合法(離子鍵、物理吸附等)、交聯(lián)劑連接法、系鏈連接法等；第二類是非共價連接法，主要指以生物素-親和素法為連接橋梁，對連接雙方進行生物素、親和素修飾，以達到連接的目的。

3 靶向超聲造影技術(shù)在心血管疾病中的應(yīng)用

微泡所能荷載遞送的治療藥物和基因種類繁多且領(lǐng)域廣泛，可以將藥物和基因遞送至靶區(qū)組織或器官，超聲靶向微泡爆破（UTMD）是利用高機械指數(shù)的超聲照射，使微泡快速膨脹、收縮、破裂，微泡內(nèi)釋放出藥物，同時產(chǎn)生的空化效應(yīng)使血管內(nèi)皮細胞間隙和細胞膜通透性增大，顯著增加了靶組織或器官中基因或藥物的局部濃度，有效增強了治療效果。靶向造影劑主要分為診斷型、治療型及多功能靶向造影劑。微泡是一種良好的遞送載體，可將生物活性分子（如藥物、納米顆粒、疫苗和治療性基因）靶向和特異性遞送到超聲可及的器官或組織中通過特異性反應(yīng)，實現(xiàn)靶向造影劑基因轉(zhuǎn)染或藥物治療。

3.1 血栓性疾病的診斷與治療

血栓是血流在心血管系統(tǒng)血管內(nèi)面剝落處或修補處的表面所形成的小塊，造成血管部分或完全堵塞，引發(fā)靜脈血栓栓塞癥和動脈粥樣硬化性血栓形成。外科手術(shù)或服用溶栓藥物雖然可以溶解血栓，但外科手術(shù)是具有侵入性的，有很多并發(fā)癥，條件限制條件導(dǎo)致風(fēng)險較大。超聲具有無創(chuàng)、便捷、快速的特點，可以靶向顯示血栓、釋放溶栓藥物及監(jiān)測血栓的溶解情況。

自1976 年Trübestein 等[23]首次成功將超聲溶解動脈血栓應(yīng)用到臨床以來，超聲溶栓就成為了超聲領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。Hagisawa 等[24]制備了靶向微泡攜帶RGD 肽序列，可以與糖蛋白GP Ⅱb/Ⅲa受體結(jié)合，活化血小板溶解血栓，通過體內(nèi)實驗和體外實驗發(fā)現(xiàn)其均能顯著增強血栓的靶向顯影。Guo 等[25]研制了一種cRGD（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys）多肽修飾的微泡，這種微泡可以特異性地靶向并顯示聚集在內(nèi)皮細胞表面的活化的血小板，證明了GP Ⅱb/Ⅲa 受體可作為血栓生物標志物，用于超聲分子成像檢測。這種血栓靶向微泡可將溶栓藥物直接遞送至血栓附近，并通過UTMD 使藥物發(fā)揮作用，是一種全新的革命性的血栓治療方法[26]。

3.2 炎癥

在微泡注射進入體內(nèi)后，中性粒細胞和單核細胞會被激活并吞噬微泡，但微泡的聲學(xué)特性并不會被破壞。在心肌缺血中，血管內(nèi)皮細胞普遍存在炎癥反應(yīng)，缺血再灌注可導(dǎo)致心肌細胞表面的ICAM-1、P-選擇素等炎癥因子的表達明顯增加[27]。紀麗景等[28]將攜帶抗P-選擇素單抗靶向微泡注入缺血再灌注鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能有效地對損傷情況進行評價。Yan 等[29]發(fā)現(xiàn)與非缺血性心肌相比，再灌注的缺血心肌中 ICAM-1 表達大量增加，其使用抗ICAM-1單抗靶向微泡注入缺血再灌注小鼠體內(nèi)，可靶向結(jié)合到心肌缺血再灌注損傷區(qū)域，輔助診斷再灌注晚期的心肌缺血。

3.3 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化在病理上大致分為三個階段：（1）早期脂肪條紋階段；（2）進展期纖維斑塊階段；（3）晚期粥樣易損斑塊階段。不穩(wěn)定斑塊的破裂會增加心肌梗死、腦卒中、猝死的風(fēng)險，因此，盡早發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定斑塊尤為重要。血管內(nèi)皮細胞損傷出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化病變形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Li 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1 靶向的超聲納米泡造影劑可以反映動脈粥樣硬化病變不同階段的炎癥損傷程度，在早期診斷和準確評估動脈粥樣硬化病變的炎癥損傷程度方面具有一定潛力。VCAM-1 也是良好的靶點，Punjabi 等[31]在研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶VCAM-1 的靶向微泡在動脈粥樣硬化小鼠和人動脈內(nèi)膜上的信號顯著增強，這種微泡可以特異性地激活內(nèi)皮細胞，實現(xiàn)超聲顯影，發(fā)現(xiàn)早期動脈粥樣硬化斑塊，從而判斷動脈粥樣硬化斑塊是否穩(wěn)定。

3.4 心肌梗死

靶向超聲微泡破壞已被證明可以改善充質(zhì)干細胞（MSC）歸巢，增加缺血心肌中基質(zhì)細胞衍生因子1（SDF1）表達，F(xiàn)ujii 等[32]將含有SDF1 的微泡聯(lián)合UTMD 技術(shù)治療急性心肌梗死大鼠，證明該方法可趨化干細胞，增加血管密度。靶向超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染心肌組織可以避免直接注射法帶來的有創(chuàng)性和現(xiàn)有載體的局限性，使心肌中有關(guān)血管生長因子基因高效表達，促進缺血心肌血管的新生。Sun 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，利用靶向超聲造影技術(shù)向缺血心肌輸送脯氨酰羥化酶2（PHD2）短發(fā)夾RNA（shRNA）修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞（BMC），可改善心肌毛細血管通透性，改變?nèi)毖募【植课h(huán)境，促進干細胞歸巢。Wei 等[34]將攜帶半乳糖凝集素-7（galectin-7）小干擾RNA（siRNA）的微泡用于治療急性心肌梗死大鼠，增強了BMC 歸巢能力，改善了心肌微環(huán)境。Chen 等[35]研究發(fā)現(xiàn)，UTMD 技術(shù)延遲向缺血心肌輸送BMC，可顯著減輕缺血再灌注后的心臟重塑，增大毛細血管密度，促進心肌細胞增殖，促進血管生成并誘導(dǎo)VEGF 分泌。

3.5 心臟移植急性排斥反應(yīng)

心臟移植技術(shù)的不斷完善和免疫抑制劑的開發(fā)應(yīng)用使得心臟移植逐漸成為治療終末期心力衰竭的有效方法。然而，心臟移植過程中易引發(fā)急性排斥反應(yīng)，導(dǎo)致患者死亡。近年研究發(fā)現(xiàn)，將UTMD聯(lián)合心肌超聲成像可以定量評估急性排斥反應(yīng)的程度。王卓等[36]使用了ICAM-1 修飾微泡，該微泡能夠特異性聚集在心臟移植后的急性排斥反應(yīng)發(fā)生區(qū)域，同時使用UTMD 產(chǎn)生聲孔效應(yīng)，使siRNA 直接進入細胞內(nèi)，從而提升siRNA 轉(zhuǎn)染率，有效地抑制急性排斥反應(yīng)。Kondo 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，細胞親和性靶向微泡和抗ICAM-1 抗體靶向脂質(zhì)微泡，能夠從細胞和分子水平檢測心臟移植后急性排斥反應(yīng)的病理和代謝改變，為診斷心臟移植后急性排斥反應(yīng)提供了新方法。

4 總結(jié)與展望

靶向超聲造影劑的出現(xiàn)使分子成像逐步從MRI、CT、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、血管造影等昂貴或侵入性檢查逐漸向價廉、快捷、無創(chuàng)、無輻射相關(guān)風(fēng)險、無已知副作用、很少導(dǎo)致患者不適感的超聲分子成像轉(zhuǎn)變，超聲分子成像具有低免疫原性、低毒性、無創(chuàng)、器官組織特異性、可重復(fù)作用等諸多優(yōu)點。因此，超聲成像在臨床診斷中使用頻率最高，超聲造影劑可以顯著增強超聲圖像的分辨率和對比度，是醫(yī)學(xué)超聲的第三次革命。

在著眼于臨床應(yīng)用前景的同時，還需要進一步解決一些困難：（1）目前多數(shù)開展的實驗為動物實驗?？紤]到人類環(huán)境的復(fù)雜性和異質(zhì)性，UTMD 的應(yīng)用仍需要進一步的臨床試驗。（2）不同部位或器官影響了治療方案的選擇，因此，考慮器官的免疫異質(zhì)性和個體遺傳背景，選擇匹配良好的微泡是UTMD 治療策略不可忽視的一部分。（3）目前市售的微泡僅用于增強成像，與藥物、基因和疫苗結(jié)合的新型微泡需要優(yōu)化和適應(yīng)，以供將來臨床應(yīng)用。（4）需要繼續(xù)研究 UTMD 的最佳參數(shù)。治療效果不僅與超聲參數(shù)如頻率、力學(xué)指標、照射時間有關(guān)，還與微泡劑量、環(huán)境溫度、空氣濕度、組織類型等非超聲因素有關(guān)。適當?shù)奈⑴蓊愋秃吐晫W(xué)參數(shù)是治療方案的關(guān)鍵部分。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突