李航 蘇夢迪 黃浪平 馬嘯 王歡歡 敖飛 胡麗濤 張松濤

（1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，450002，河南鄭州；2 中國煙草總公司重慶市公司豐都分公司，408200，重慶）

土壤微生物種類繁多、數(shù)量巨大、代謝活動頻繁，微生物群落被視為土壤生態(tài)系統(tǒng)健康和恢復(fù)土壤功能水平的指標[1-2]。根際是植物、土壤及微生物相互作用的中心，土壤中的氮、磷、鉀等有效養(yǎng)分通過根際被煙草吸收，因而土壤微生物在改善土壤結(jié)構(gòu)、維持土壤養(yǎng)分和拮抗病害等方面起著重要作用[3-5]。土壤真菌是土壤微生物的重要組成之一，在土壤的營養(yǎng)循環(huán)、有機質(zhì)的形成分解和肥力改善等方面作用顯著，作為自然界的分解者，真菌比細菌能更好地降解復(fù)雜化合物[6-8]。因此，根際土壤真菌在一定程度上可以體現(xiàn)土壤速效養(yǎng)分和環(huán)境質(zhì)量狀況。

氮、磷和鉀肥的施用是保障煙葉產(chǎn)質(zhì)量的重要農(nóng)業(yè)措施，其能通過改變土壤養(yǎng)分含量影響參與土壤養(yǎng)分循環(huán)的真菌多樣性[9-11]。氮肥是影響真菌群落的敏感因子，能夠顯著影響土壤中真菌多樣性，改變真菌群落結(jié)構(gòu)，與土壤pH 相比，土壤養(yǎng)分對真菌影響較大[12-15]。關(guān)于磷肥和鉀肥對作物產(chǎn)質(zhì)量影響等方面的研究較多，而對土壤微生物多樣性影響的研究較少。磷肥是影響灰牧草根際微生物的主要因素[16]，磷鉀肥配施可以改變菌群結(jié)構(gòu)，顯著降低叢枝菌根真菌的數(shù)量和多樣性[17]。此外，土壤中的銨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化時會產(chǎn)生大量的H+，使得微生物由細菌主導(dǎo)過渡到真菌主導(dǎo)[18]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，土壤微生態(tài)的研究逐漸深入。氮、磷、鉀是煙草生長發(fā)育的關(guān)鍵影響因子，目前，關(guān)于氮磷鉀對煙草的影響報道較多，但其對植煙土壤根際微生物多樣性的影響尚不明確。因此，本研究通過研究不同氮磷鉀配施對植煙土壤速效養(yǎng)分和煙草根際土壤真菌多樣性的影響，明確氮磷鉀對土壤真菌群落的影響機制，為通過調(diào)控土壤速效養(yǎng)分和真菌多樣性提高作物產(chǎn)量和質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2020 年在重慶市豐都縣太平壩鄉(xiāng)開展，該地肥力中等，地形平坦，氣候溫和、雨熱同期，年降水量在1000mm 以上。供試土壤的基本理化性質(zhì)為堿解氮 168mg/kg 、速效磷57.5mg/kg、速效鉀373mg/kg、pH 5.2。

1.2 試驗材料

供試單質(zhì)肥料為硝酸銨（含N 35%）、重過磷酸鈣（含P2O543%）和硫酸鉀（含K2O 50%）。供試煙草品種為當?shù)刂髟云贩N云煙116（Nicotiana tabacumL.cv.Yunyan116）。

1.3 試驗設(shè)計

采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置5 個處理，分別為CK（不施肥）、NPK（氮磷鉀）、PK（磷鉀）、NK（氮鉀）和NP（氮磷）。NPK 處理供氮、磷和鉀量分別為111.00、105.75 和374.55kg/hm2。不同施肥處理肥料用量如表1 所示，各處理不使用其他肥料，每個處理3 次重復(fù)，小區(qū)隨機排列，設(shè)置保護行。株距和行距分別為0.5 和1.2m（約15 810 株/hm2），小區(qū)面積66.7m2。除施肥外，各小區(qū)其他田間管理措施相同。

表1 不同施肥處理肥料用量Table 1 Fertilizer dosage for different fertilization treatments kg/hm2

1.4 土壤樣品的采集與測定

移栽后30、60 和90d 分別是煙草的伸根期、旺長期和成熟期的關(guān)鍵節(jié)點，也是煙草干物質(zhì)積累和養(yǎng)分吸收的關(guān)鍵節(jié)點。分別于移栽后30、60和90d 采樣，每個處理隨機選取長勢均勻一致的煙株，在不破壞根系的前提下將煙株根部及其附近土壤用鏟子完整挖出，用抖根法[19]輕輕抖落煙草根部周圍的土壤，裝入自封袋，-80℃冰箱保存。收集時注意去除表層0～5cm 的土壤、石塊和動植物殘體。

采集2 株中間位置寬5cm、深0～20cm 的土壤樣品，晾干后磨碎，過20 目篩，封入自封袋待測。按照鮑士旦[20]的方法測定土壤理化性質(zhì)，采用堿解擴散法測定堿解氮含量，采用碳酸氫鈉比色法測定速效磷含量，采用醋酸銨-火焰光度計法測定速效鉀含量，采用pH 計測定pH。

1.5 土壤DNA 提取、擴增與高通量測序

采用DNA 試劑盒提取土壤樣品DNA，使用NanoDrop2000 檢測其濃度。以提取的DNA 為模板，使用真菌ITS 多樣性鑒定引物[21]（F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；R：5'-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）進行PCR 擴增。由上海歐易生物技術(shù)有限公司完成Miseq 文庫構(gòu)建，測序平臺為Illumina Miseq。測序數(shù)據(jù)預(yù)處理后使用Vsearch（version 2.4.2）軟件[22]按照97%相似度進行OTU 分類，采用Blast 軟件[23]和Unite 數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)的比對和注釋。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用歐易生物云平臺和WPS 進行數(shù)據(jù)分析，使用DPS 7.05 軟件進行方差分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進行差異顯著性檢驗（P＜0.05），使用Origin 軟件進行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤速效養(yǎng)分的影響

如表2 所示，在移栽后30 和60d，不同施肥處理對土壤速效養(yǎng)分影響差異顯著。在移栽后30d，施肥處理降低了土壤的pH，尤其是NPK 處理。NK 處理堿解氮含量比CK 和NPK 處理顯著增加，PK 處理則顯著增加了速效磷和速效鉀含量。在移栽后60d，施肥處理，尤其是NK 和NP處理的土壤pH 顯著降低，NP、NK 和PK 處理的堿解氮含量顯著低于CK 和NPK 處理，NP 處理的土壤速效磷含量顯著增加，NK、PK 和NPK 處理顯著增加了土壤速效鉀含量。在移栽后90d，不同施肥處理對土壤堿解氮、速效磷和pH 無顯著影響，而NPK 和PK 處理的土壤速效鉀含量顯著增加。結(jié)果表明，不同施肥處理在移栽后30 和60d對土壤速效養(yǎng)分影響較大，而在移栽后90d 影響較小。

表2 不同施肥處理對土壤速效養(yǎng)分的影響Table 2 Effects of different fertilization treatments on soil nutrients

2.2 測序數(shù)據(jù)和真菌α多樣性分析

采用Illumina MiSeq 測序平臺對45 個土壤樣品進行測序，共獲得有效序列3 247 007 條，按97%相似度進行OTU 分類，共獲得4737 個OTU。物種累積曲線隨測序數(shù)量的增加由急劇升高變?yōu)橼呌谄教梗▓D1），平均測序覆蓋度達99%以上（表3），說明抽取的樣本包含大部分微生物，測序數(shù)據(jù)合理可靠。

圖1 物種累積曲線Fig.1 Species accumulation curve

表3 不同施肥處理真菌群落α指數(shù)Table 3 Alpha index of fungal community in different fertilization treatments

如表3 所示，不同施肥處理對土壤真菌豐富度和多樣性影響程度不同。移栽后30d，與CK 處理相比，施肥處理降低了真菌的辛普森指數(shù)，NK 處理顯著降低了真菌的香農(nóng)指數(shù)，而施肥處理對真菌的Chao1 指數(shù)和物種數(shù)量無顯著影響。在移栽后60d，與CK 處理相比，施肥處理對真菌的辛普森指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和物種數(shù)量無顯著影響，PK 處理顯著降低了真菌的Chao1 指數(shù)。在移栽后90d，不同施肥處理對真菌群落α指數(shù)無顯著影響。說明施肥處理在移栽后30d 主要影響真菌的多樣性，而在移栽后60d 主要影響真菌的豐富度。

2.3 不同施肥處理土壤真菌OTU 分布

如圖2 所示，在移栽后30d，NPK、PK、NK、NP 和CK 處理的OTU 數(shù)量分別為890、1234、858、1036 和924，特有OTU 數(shù)量分別為284、364、157、294 和213，共有OTU 數(shù)量為305；在移栽后60d，OTU 數(shù)量分別為1211、954、965、1044 和1189，特有OTU 數(shù)量分別為334、206、205、233 和294，共有OTU 數(shù)量為333；在移栽后90d，OTU 數(shù)量分別為1152、1559、1197、1195 和1261，特有OTU數(shù)量分別為181、431、230、216 和239，共有OTU數(shù)為412。此外，在移栽后3 個時期，施肥處理和CK 特有OTU 數(shù)量表現(xiàn)不同。由此可見，不同施肥處理對土壤真菌OTU 數(shù)量的影響不同。

圖2 不同施肥處理對土壤真菌OTU 影響的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of effects of different fertilization treatments on soil fungal OTUs

2.4 不同處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 真菌門水平群落結(jié)構(gòu)分析 如圖3 所示，物種注釋結(jié)果表明，45 個土壤樣本中真菌在門水平歸為8 個門類，包括子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（ Chytridiomycota ） 、球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、絲足蟲門（ Cercozoa ）和芽枝霉門（Blastocladiomycota）。其中，相對豐度大于1%的優(yōu)勢門類為子囊菌門、接合菌門、擔子菌門和壺菌門，其相對豐度之和占所有可注釋菌門的84.12%～94.40%。在移栽后30d，不同施肥處理壺菌門相對豐度低于CK，并且施氮處理NP、NK 和NPK 的接合菌門相對豐度均低于不施氮處理PK 和NP。這些結(jié)果表明，在移栽后30d，施肥處理能夠降低壺菌門真菌的相對豐度，其中施氮處理降低了接合菌門相對豐度。在移栽后60d，不同施肥處理的壺菌門和擔子菌門相對豐度均高于CK，而接合菌門相對豐度則均低于CK；施氮處理NPK、NK和NP 處理的子囊菌門均高于不施氮處理PK 和NP。該結(jié)果表明，在移栽后60d，施肥處理可以增加壺菌門和擔子菌門相對豐度，而降低接合菌門相對豐度，其中施氮處理能夠增加子囊菌門相對豐度。在移栽后90d，施肥處理的子囊菌門和擔子菌門相對豐度均高于CK，而接合菌門和壺菌門相對豐度均低于CK。以上說明，在移栽后90d 不同施肥處理通過增加子囊菌門和擔子菌門、降低接合菌門和壺菌門的相對豐度影響真菌群落結(jié)構(gòu)。

圖3 不同處理真菌門水平物種相對豐度（a）和前4 位優(yōu)勢菌門相對豐度（b）Fig.3 Relative abundances of the fungal phylum under different treatments(a)and relative abundances of dominant phyla in top four under different treatments(b)

2.4.2 真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)分析 如圖4 所示，不同施肥處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大，相對豐度大于1% 的優(yōu)勢屬主要包括腐質(zhì)霉屬（Humicola）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、產(chǎn)油菌屬（Solicoccozyma）、油瓶霉屬（Lecythophora）、鐮刀菌屬（Fusarium）和被孢霉屬（Mortierella）。在移栽后30d，木霉屬相對豐度介于15.50%～53.36%，是絕對優(yōu)勢菌屬；施肥處理，尤其是NPK、NK 和NP 處理提高了木霉屬和青霉屬的相對豐度，降低了鐮刀菌屬的相對豐度。在移栽后60d，施肥處理提高了木霉屬的相對豐度，而施氮處理NPK、NK 和NP 則提高了青霉屬的相對豐度。在移栽后90d，施肥處理提高了腐質(zhì)霉屬的相對豐度，降低了木霉屬、青霉屬和鐮刀菌屬的相對豐度。可見，不同施肥處理通過提高木霉屬和青霉屬相對豐度、降低鐮刀菌屬相對豐度來影響真菌群落結(jié)構(gòu)。

圖4 不同處理真菌屬水平物種相對豐度（a）和前3 位、第6 位優(yōu)勢菌屬相對豐度（b）Fig.4 Relative abundances of the fungal genus under different treatments(a)and relative abundances of dominant fungal genera(Top 1,2,3,6)under different treatments(b)

2.5 土壤真菌群落組成與土壤速效養(yǎng)分的關(guān)系

從圖5a 中可以看出，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對真菌優(yōu)勢門水平相對豐度的差異解釋度分別為11.58%和88.12%，影響真菌門水平相對豐度的土壤因子依次為速效磷、速效鉀、pH 和堿解氮。其中，擔子菌門相對豐度與速效磷和速效鉀呈正相關(guān)，與pH 和堿解氮呈負相關(guān)；而子囊菌門和壺菌門相對豐度與堿解氮、速效鉀、速效磷和pH 均呈負相關(guān)。此外，接合菌門相對豐度與堿解氮、速效鉀、速效磷和pH 均呈正相關(guān)。如圖5b 所示，PC1 和PC2 對真菌優(yōu)勢屬水平相對豐度的差異解釋度分別為39.14%和57.42%，影響真菌屬水平相對豐度的土壤因子依次為堿解氮、速效鉀、速效磷和pH。其中，木霉屬相對豐度與土壤堿解氮呈正相關(guān)，與速效鉀、速效磷和pH 均呈負相關(guān)，而鐮刀菌屬相對豐度與速效磷和pH 呈正相關(guān)，與堿解氮和速效鉀呈負相關(guān)。此外，青霉屬相對豐度與堿解氮、速效鉀、速效磷和pH均呈負相關(guān)。由此說明，堿解氮、速效磷、速效鉀和pH 等土壤速效養(yǎng)分對真菌群落的影響較大。其中，速效磷和堿解氮是影響豐都縣植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。

圖5 土壤真菌優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬相對豐度與土壤理化因子的RDA 分析Fig.5 Relationship between relative abundance of fungal community at phyluml genus and soil chemical factors by RDA

3 討論

土壤真菌作為植物根際微生態(tài)的重要組成部分，通常會隨著環(huán)境的變化而改變，通過分解有機質(zhì)、影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等維持土壤養(yǎng)分的動態(tài)平衡和穩(wěn)定[24-25]。本研究中，不同施肥處理對土壤速效養(yǎng)分的影響較為顯著，尤其是氮肥會降低土壤pH。施用化肥是導(dǎo)致土壤酸化的重要人為因素[26]，施用化肥通過促使肥料或土壤中的NH4+向NO3-轉(zhuǎn)化，釋放大量的H+導(dǎo)致土壤pH 降低，這可能是植煙土壤酸化的原因之一[27]。而土壤酸化通過改變真菌群落的結(jié)構(gòu)影響了土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和有效性[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著煙草的生長發(fā)育，不同施肥處理導(dǎo)致土壤真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生變化，這可能是由于不同施肥處理降低了土壤pH，進而影響了土壤真菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)[30-31]。

不同施肥處理通過改變土壤養(yǎng)分影響真菌群落結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同施肥處理能夠增加土壤速效磷含量，同時RDA 分析表明，土壤速效磷對子囊菌門和擔子菌門相對豐度影響最為顯著。土壤速效磷對土壤微生物的影響可能是通過改變土壤pH，進而影響微生物的群落結(jié)構(gòu)[32]。子囊菌門和擔子菌門真菌多為腐殖真菌，是根際土壤中養(yǎng)分的關(guān)鍵分解者和常見的優(yōu)勢菌門[33-34]。其中，子囊菌門主要分解難降解的有機質(zhì)[35]，擔子菌門則是木質(zhì)素和纖維素的分解者，能與植物形成外生菌根[7,36-37]。這些真菌對土壤pH 的改變極為敏感[38-39]，而土壤pH 可能通過影響土壤有機碳、總氮和碳氮比等土壤性質(zhì)以及調(diào)控真菌群落的競爭關(guān)系，進而影響真菌群落組成[40-43]。此外，研究發(fā)現(xiàn)土壤速效磷和堿解氮的改變影響微生物的群落組成[44]，土壤速效鉀影響真菌菌絲對營養(yǎng)的吸收[45]。因此，不同施肥處理通過改變土壤養(yǎng)分影響真菌門水平的群落結(jié)構(gòu)。

在屬水平上，木霉屬相對豐度與土壤堿解氮呈正相關(guān)，與土壤pH 呈負相關(guān)，而鐮刀菌屬相對豐度與土壤pH 呈正相關(guān)，與堿解氮呈負相關(guān)。木霉屬真菌能夠抑制植物病原菌，防治多種病害，促進植物生長，提高作物產(chǎn)量[46-47]；而鐮刀菌屬則是煙草根腐病致病菌屬[48]。本研究發(fā)現(xiàn)，在移栽后30d，施肥處理提高了土壤堿解氮含量，降低了土壤pH。同時，施肥處理增加了木霉屬相對豐度，降低了鐮刀菌屬相對豐度。土壤氮含量的增加會減少作物與真菌的競爭[49-50]，而木霉屬真菌可利用氮素促進菌絲的生長[51]，這可能是木霉屬相對豐度增加的原因。施肥通過提高土壤堿解氮含量和降低土壤pH 增加了木霉屬相對豐度，降低了鐮刀菌屬的相對豐度。此外，腐質(zhì)霉屬是纖維素和木質(zhì)素的分解者[52]，其相對豐度與土壤堿解氮含量呈正相關(guān)，其原因有待進一步探究。因此，不同施肥處理可能是通過改變土壤堿解氮含量和pH來影響真菌群落結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

不同施肥處理對土壤速效養(yǎng)分的影響較為顯著，施肥尤其是施氮肥會降低土壤pH。不同施肥處理降低了土壤真菌多樣性（移栽后30d）和豐富度（移栽后60d），并通過改變土壤養(yǎng)分和pH 影響真菌門和屬水平的群落結(jié)構(gòu)。重慶市豐都縣植煙土壤中的堿解氮、速效磷、速效鉀和pH 對真菌群落的組成影響顯著，其中速效磷和堿解氮是主要影響因子。