陳翠萍 閆殿海 張書(shū)苗 左皓南 高森 劉洋

（1 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，810016，青海西寧；2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測(cè)試（西寧）分中心，810016，青海西寧）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）是一年生的莧科藜屬雙子葉植物，原產(chǎn)自南美洲安第斯山脈地區(qū)，又稱(chēng)為南美藜和奎奴亞藜等，有5000～7000年的栽培歷史[1]。藜麥營(yíng)養(yǎng)均衡、蛋白質(zhì)含量高且氨基酸組成完美，富含礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸和維生素等成分，由于其營(yíng)養(yǎng)組成豐富，現(xiàn)已成為炙手可熱的商品作物[2-5]。藜麥的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值被聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）認(rèn)為是唯一一種可以滿(mǎn)足人類(lèi)基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物[6]。

早在1987 年，我國(guó)西藏農(nóng)牧學(xué)院和西藏農(nóng)業(yè)科學(xué)院便開(kāi)始了藜麥的引種試驗(yàn)[7]。目前，藜麥已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革種植結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要作物。由于藜麥?zhǔn)且M(jìn)作物，在引進(jìn)過(guò)程中出現(xiàn)品種多、亂、雜、遺傳背景和遺傳信息等種質(zhì)特征不清楚的問(wèn)題，導(dǎo)致不易進(jìn)行種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)、研究和利用，極大地限制了藜麥產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。早期的種質(zhì)資源遺傳多樣性研究多使用的是形態(tài)學(xué)標(biāo)記法、系譜分析法以及同工酶法，隨著DNA 分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，RFLP（restriction fragment length polymorphism）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）以及SSR（simple sequence repeats）等分子標(biāo)記技術(shù)用來(lái)進(jìn)行遺傳多樣性分析研究，其中SSR 分子標(biāo)記具有靈敏度強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、分布較廣和多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，已在遺傳多樣性分析、分子育種、指紋圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[8-11]。目前，小麥、玉米和大豆等作物的指紋圖譜已有多篇報(bào)道[12-14]，但藜麥的指紋圖譜鮮有報(bào)道。

本研究利用SSR 分子標(biāo)記法對(duì)不同來(lái)源的96份藜麥材料進(jìn)行SSR 引物的篩選，構(gòu)建藜麥DNA指紋圖譜和遺傳多樣性分析。同時(shí)，SSR 引物的多態(tài)性評(píng)價(jià)也為藜麥品種鑒定和DUS 測(cè)試中指紋圖譜的構(gòu)建及近似品種的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)收集國(guó)內(nèi)外藜麥種質(zhì)材料共計(jì)96 份，由青海省農(nóng)林科學(xué)院作物育種栽培研究所提供，各材料均在青海連續(xù)自交種植多年以上，種質(zhì)材料編號(hào)和來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 藜麥材料的編號(hào)及來(lái)源Table 1 The numbers and sources of quinoa materials

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藜麥基因組DNA 的提取 試驗(yàn)于2020 年4-10 月在青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行。在藜麥苗期，選取5 株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，混合等量葉片，利用CTAB 法提取藜麥基因組DNA，利用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA 的濃度和純度，并將其保存在-20℃冰箱中[15-17]。

1.2.2 引物 選取表型差異較大的4 份藜麥DNA，從221 對(duì)引物中篩選具有多態(tài)性、條帶清晰且穩(wěn)定的引物用于96 份藜麥種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析。221 對(duì)引物均來(lái)源于Jarvis 等[17]公布的引物信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 采用左皓南等[18]擴(kuò)增程序的方法，94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min 9個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)減0.5℃，94℃30s，55℃45s，72℃1min 2 個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。并根據(jù)不同SSR 引物的特性調(diào)節(jié)退火溫度。

1.2.4 電泳產(chǎn)物檢測(cè) 利用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行垂直電泳檢測(cè)，進(jìn)行銀染染色，NaOH、甲醛溶液顯色和漂洗，讀帶并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，將同一引物擴(kuò)增出的大小相同的條帶視為1 個(gè)等位變異，并進(jìn)行記錄。在96 個(gè)DNA 樣本中同一等位基因位點(diǎn)上有相同明顯條帶的記作1，無(wú)明顯條帶則記作0，以此做出“0-1”矩陣型讀帶表。利用PopGen 32 軟件分析讀帶表，計(jì)算出多態(tài)性指數(shù)等，采用NTSYSpc 2.1 軟件進(jìn)行UPGMA 方法聚類(lèi)分析并做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記在96份藜麥種質(zhì)材料上的多態(tài)性分析

從221 對(duì)SSR 引物中共篩選出18 對(duì)（表2）具有特異性條帶的引物。18 對(duì)SSR 引物在96 份藜麥種質(zhì)材料中共得到了94 個(gè)等位基因位點(diǎn)，每對(duì)引物的等位基因位點(diǎn)在3～10 個(gè)，平均每對(duì)引物可檢測(cè)到的等位基因位點(diǎn)數(shù)為5.2（表3 和圖1）。其中KAAT021 檢測(cè)到的等位基因位點(diǎn)數(shù)最多，為10 個(gè)；KGA010、KGA100 和BGA200 最少，僅為3 個(gè)，其余14 對(duì)引物在4～7 個(gè)。

圖1 引物KGA145 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of amplification by KGA145

表2 SSR 引物的序列信息Table 2 Sequence information of SSR primers

表3 18 對(duì)SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Amplification results of 18 pairs of SSR primers

18 對(duì)SSR 標(biāo)記的觀察雜合度（Ho）的變化范圍為0.16～0.55，均值為0.36；期望雜合度（He）的變化范圍為0.13～0.35，平均值為0.24；Shannon多樣性指數(shù)（I）變化范圍為0.23～0.52，平均值為0.37；多態(tài)信息含量（PIC）的變化范圍為0.19～0.38，平均值為0.28。其中，KGA100 和KCAA015的PIC 和I都較高，表明KGA100 和KCAA015 具有較高的多態(tài)性檢測(cè)效率。

2.2 DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的初步構(gòu)建

將某一品種從其余95 個(gè)品種中區(qū)分開(kāi)的特征引物共有16 個(gè)（KAAT001、KAAT016、KAAT041、KCAA015、KGA010、KGA100、KGA128、KGA134、KGA145、KGA156、BGA200、KAAT018、KAAT021、KCAA078、KCAA065、KGA114），其中KAAT041可以一次性區(qū)分12 個(gè)品種，分別是BZ-46、BZ-32、BZ-29、BZ-66（W）、BZ-68（P）、BZ-42、BZ-46、BZ-68（P）、PB-03、y1-10、BZ-62、y1-24。能將2～3 個(gè)品種鑒定出來(lái)的引物共有17 對(duì)，利用這類(lèi)引物組合可進(jìn)行品種鑒定，使其操作簡(jiǎn)單且具有高效性。為了構(gòu)建指紋圖譜，利用2 種或2 種以上的引物可提高鑒別的準(zhǔn)確性，經(jīng)分析，組合利用上述18對(duì)多態(tài)性引物可將96 份DNA 樣品完全鑒別。

利用18 對(duì)引物對(duì)96 份藜麥DNA 材料擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行遺傳多樣性分析，綜合分析引物多態(tài)信息含量值的大小、引物帶型統(tǒng)計(jì)難易程度和Shannon多樣性指數(shù)，以十進(jìn)制數(shù)字進(jìn)行編碼，構(gòu)建96 份藜麥種質(zhì)材料的指紋圖譜，表4 為部分藜麥種質(zhì)的指紋圖譜（表中數(shù)字為引物對(duì)該品種可擴(kuò)增出的條帶數(shù)），用于構(gòu)建96 份種質(zhì)材料指紋圖譜的引物組合見(jiàn)表5。

表4 部分藜麥種質(zhì)指紋圖譜Table 4 Fingerprint of some quinoa germplasms

表5 96 份藜麥材料指紋圖譜的引物組合Table 5 Primer combinations for identification of 96 quinoa materials

2.3 遺傳多樣性分析

對(duì)96 份種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果（圖2）表明，供試材料之間的遺傳相似系數(shù)介于0.55～0.98，平均為0.77。其中BZ-04 和BZ-38，BZ-07 和BZ-14 的遺傳相似系數(shù)（0.98）最大。而B(niǎo)Z-18與BZ-24 遺傳相似系數(shù)（0.55）最小。不同材料之間的遺傳相似系數(shù)值大多分布在0.60～0.80，分別占34.82%和46.41%，這表明96 份藜麥種質(zhì)材料親緣關(guān)系較近。

圖2 遺傳相似系數(shù)分布Fig.2 Distribution of genetic similarity coefficients

根據(jù)不同種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)對(duì)96 份藜麥種質(zhì)材料進(jìn)行UPGMA 法聚類(lèi)分析（圖3）。在相似系數(shù)為0.31 處將96 份藜麥種質(zhì)材料分為3 個(gè)類(lèi)群，其中，類(lèi)群Ⅰ主要包括中國(guó)西藏、青海、甘肅3 個(gè)地區(qū)共65 份種質(zhì)材料；類(lèi)群Ⅱ包括中國(guó)西藏的2 份種質(zhì)材料（BZ-18 和BZ-19）；類(lèi)群III 包含29份種質(zhì)材料，多為阿根廷種質(zhì)材料。在相似系數(shù)0.33 處可將類(lèi)群Ⅰ進(jìn)一步分為3 個(gè)亞類(lèi)，其中第1亞類(lèi)包含33 份種質(zhì)，其中西藏23 份、青海西寧3份、青海海西4 份、甘肅3 份；第2 亞類(lèi)包含24份種質(zhì)，其中西藏4 份、青海西寧18 份、青海海西2 份；第3 亞類(lèi)包含8 份種質(zhì)，全來(lái)自青海海西。在相似系數(shù)0.32 處可將類(lèi)群Ⅲ分為2 個(gè)亞類(lèi)，其中第1 亞類(lèi)包含8 份種質(zhì)，其中中國(guó)西藏7 份，中國(guó)青海西寧1 份；第2 亞類(lèi)21 份種質(zhì)，全部為阿根廷種質(zhì)材料。

圖3 96 份藜麥種質(zhì)資源聚類(lèi)分析Fig.3 Cluster analysis of 96 quinoa germplasms

3 討論

SSR 分子標(biāo)記是基于PCR 技術(shù)的一種分子標(biāo)記，在基因組中的多態(tài)性很高。它克服了RFLP、RAPD 等標(biāo)記的不足，被認(rèn)為是研究遺傳多樣性較為有效的分子標(biāo)記系統(tǒng)，越來(lái)越被廣泛應(yīng)用。

本研究共篩選了221 對(duì)SSR 引物，能夠擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的引物僅有18 對(duì)，占比8.1%。品種間SSR 分子標(biāo)記的多態(tài)性相對(duì)較差，可能是由于96份藜麥材料的遺傳差異性較小和親緣關(guān)系接近等原因，綜合表現(xiàn)為較低的多態(tài)性。每對(duì)引物的平均等位基因數(shù)為5.2，而Fuentes 等[19]檢測(cè)59 份智利藜麥種質(zhì)得出每對(duì)SSR 引物檢測(cè)到7.5 個(gè)等位基因，Christensen 等[20]得出每對(duì)引物平均擴(kuò)增11 個(gè)等位基因，宋嬌[21]利用46 對(duì)引物在114 份藜麥種質(zhì)中每對(duì)引物平均擴(kuò)增3.59 個(gè)等位變異數(shù)。由此可見(jiàn)，平均等位基因數(shù)量的多少與所用分子標(biāo)記有關(guān)，也與所選種質(zhì)資源之間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有關(guān)。因此，在選用SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中盡可能選用等位基因數(shù)量較多的分子標(biāo)記。

本試驗(yàn)聚類(lèi)分析結(jié)果表明，來(lái)自于阿根廷地區(qū)的種質(zhì)被單獨(dú)聚為一大類(lèi)，說(shuō)明相同地域的品種更容易被聚為一類(lèi)，但是也有交叉現(xiàn)象，比如來(lái)源于我國(guó)西寧PB-06 編號(hào)的種質(zhì)與阿根廷種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)接近，說(shuō)明親緣關(guān)系接近。聚類(lèi)分析將96份藜麥種質(zhì)分為3 個(gè)類(lèi)群，類(lèi)群Ⅰ品種最多，為中國(guó)西藏、甘肅和青海的種質(zhì)材料，且大部分西藏種質(zhì)和青海海西種質(zhì)材料的親緣關(guān)系更加接近，表明這些種質(zhì)材料可能是從同一親本材料或者親緣關(guān)系較近的種質(zhì)材料引種的；類(lèi)群Ⅱ僅有中國(guó)西藏2份種質(zhì)，可能是隨著地理區(qū)域分布，2 份種質(zhì)材料與其余的種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；類(lèi)群Ⅲ多為阿根廷種質(zhì)，表現(xiàn)出明顯的地域性。聚類(lèi)分析的結(jié)論也驗(yàn)證了亞群分布與地理區(qū)域密切相關(guān)[22]。在對(duì)藜麥進(jìn)行遺傳多性分析和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)結(jié)合表型性狀和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)[23]。

分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)標(biāo)記相較而言穩(wěn)定性和特異性更高，因此，利用分子標(biāo)記為基礎(chǔ)構(gòu)建的DNA指紋圖譜鑒別植物品種更準(zhǔn)確。SSR 分子標(biāo)記已經(jīng)成功應(yīng)用在多個(gè)作物的指紋圖譜構(gòu)建方面[24-26]。利用分子標(biāo)記構(gòu)建藜麥指紋圖譜的研究還較為少見(jiàn)。本研究利用篩選出的18 對(duì)多態(tài)性引物可將96 份DNA 樣品完全鑒別，所篩選的SSR 分子標(biāo)記為藜麥種質(zhì)分類(lèi)、指紋圖譜構(gòu)建、品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供重要的理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

共篩選出了18對(duì)適用于藜麥的SSR分子標(biāo)記，并對(duì)96 份來(lái)源不同的藜麥種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析和DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建，將96 份藜麥種質(zhì)材料完全區(qū)分并鑒定出來(lái)；聚類(lèi)分析將96 份藜麥種質(zhì)材料分為3 個(gè)類(lèi)群。