＊武悅 李若綺 徐勤科 郭朝暉 孫鶯*

（1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院 甘肅 730070 2.國(guó)家藥監(jiān)局中藥材及飲片質(zhì)量控制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅 730000）

靈芝孢子粉具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎癥、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸道菌群、緩解體力疲勞、保肝護(hù)肝、改善睡眠[1-5]等藥理作用，近幾年還有報(bào)道證實(shí)靈芝孢子粉對(duì)阿爾茲海默癥有一定預(yù)防作用[6]。近年來(lái)，學(xué)者發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉中脂溶性物質(zhì)含量較高，可達(dá)30%左右[7]，且這些脂溶性物質(zhì)具有一定的生物活性，其中甘油三酯類被認(rèn)為具有有效的抗腫瘤作用[8]，因此建立甘油三酯類物質(zhì)含量的測(cè)定方法于破壁靈芝孢子粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定非常重要。本試驗(yàn)采用超聲波法提取甘油酸油酸酯，建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯的含量，為破壁靈芝孢子粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1.材料與方法

(1)材料與試劑

破壁靈芝孢子粉樣品由青海及祥藥業(yè)有限公司提供；甘油三油酸酯對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供（供含量測(cè)定用，含量為：99.6%，批號(hào)：111692-202007）；二氯甲烷（色譜純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）德國(guó)默克公司。

(2)儀器與設(shè)備

Agilent 1260系列液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；Alltech ELSD-6000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Alltech科技有限公司；梅特勒XS205DU電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SBL-30DT(N)型超聲波恒溫清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

(3)儀器工作條件

①色譜條件

色譜柱：SHISEIDO CAPCELLPAK C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相:二氯甲烷:乙腈=68:32；漂移管溫度：61℃；氮?dú)饬魉伲?.7L/min。

②對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甘油三油酸酯對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成每1mL含0.7mg的溶液，即得。

(4)破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取

精密稱取破壁靈芝孢子粉0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相25mL，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用流動(dòng)相補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

(5)不同提取條件對(duì)破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取效果的影響

采用單因素試驗(yàn)考察料液比、超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取率的影響，再采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取參數(shù)。

2.結(jié)果與分析

(1)單因素試驗(yàn)結(jié)果

①料液比對(duì)甘油三油酸酯提取率的影響

由圖1可知，隨著提取溶劑的增多，甘油三油酸酯的提取效果隨之提高。當(dāng)料液比為0.1:10時(shí)，測(cè)定甘油三油酸酯的含量?jī)H為3.64%；當(dāng)料液比為0.1:25時(shí)，測(cè)得甘油三油酸酯的含量顯著升高，達(dá)4.92%；料液比為0.1:30時(shí)，測(cè)得甘油三油酸酯的含量稍有降低，為4.80%，但與料液比為0.1:25時(shí)測(cè)得甘油三油酸酯的含量差異不顯著。

圖1 料液比對(duì)甘油三油酸酯含量的影響

②超聲功率對(duì)甘油三油酸酯提取率的影響

由圖2可以看出，隨著超聲功率的增大，測(cè)得甘油三油酸酯的含量先升高后降低。當(dāng)超聲功率為560W時(shí)，測(cè)得甘油三油酸酯的含量達(dá)4.92%；超聲功率為640W時(shí)，甘油三油酸酯提取率顯著下降至4.72%。

圖2 超聲功率對(duì)甘油三油酸酯含量的影響

③超聲時(shí)間對(duì)甘油三油酸酯提取率的影響

由圖3可以看出，隨著超聲提取時(shí)間的延長(zhǎng)，測(cè)得甘油三油酸酯的含量先升高后降低。當(dāng)提取時(shí)間為30min時(shí)，甘油三油酸酯的含量達(dá)到峰值，為4.92%；超聲時(shí)間為40min時(shí)，甘油三油酸酯提取率稍有下降，為4.87%，但與超聲30min時(shí)的提取率之間差異不顯著。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)甘油三油酸酯含量的影響

④超聲溫度對(duì)甘油三油酸酯提取率的影響

由圖4可以看出，隨著超聲溫度的升高，測(cè)得甘油三油酸酯的含量先平緩升高后顯著降低。當(dāng)超聲溫度為60℃時(shí)，甘油三油酸酯的含量達(dá)4.93%；超聲溫度為80℃時(shí)，甘油三油酸酯提取率顯著下降至3.62%。

圖4 超聲提取溫度對(duì)甘油三油酸酯含量的影響

(2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取的最佳條件為：料液比為0.1:25（g·mL-1），超聲功率為560W，超聲時(shí)間為30min，超聲溫度為60℃。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料液比、超聲功率和超聲時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行三因素三水平的Box-Benhnken試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化并篩選最佳的溶解條件（表1～表2）。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)表3中得到的提取率進(jìn)行回歸分析，得到如下回歸方程：

表3 回歸模型及因素的方差分析

經(jīng)方差分析可知（表3），該模型方程極顯著。在本試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，因素A、C、A2、B2、C2、AB、AC對(duì)甘油三油酸酯提取率影響極顯著。模型的失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明回歸方程較好的擬合了試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)誤差小。

(3)驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design Expert軟件獲得最佳提取條件：料液比為0.1:22.01，超聲功率為550.93W，超聲時(shí)間為31.19min，破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取率為5.08%。在各因素最佳條件下對(duì)響應(yīng)面分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，考慮實(shí)際操作性，將最優(yōu)提取條件修正為料液比0.1:25（g·mL-1），超聲功率為560W，超聲時(shí)間為30min。在此基礎(chǔ)上試驗(yàn)進(jìn)行五次，最終得到甘油三油酸酯平均提取率為5.01%，與預(yù)測(cè)值5.08%相近，相對(duì)誤差為1.4%，表明模型可靠，可以用于破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取。

3.結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯提取方法。利用響應(yīng)面建立甘油三油酸酯提取率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并對(duì)三因素的響應(yīng)值影響進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明，所建模型擬合度高，實(shí)驗(yàn)誤差小，最終確定提取條件為料液比0.1:25（g·mL-1），超聲功率560W，超聲時(shí)間30min。在此條件下，破壁靈芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取率為5.01%，與預(yù)測(cè)值接近，模型可靠。