秦家軒 林達(dá)偉 邢金春

四個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域基因1(four and a half LIM domains 1, FHL1)蛋白含有四個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域,LIM結(jié)構(gòu)域通過調(diào)節(jié)蛋白相互作用來參與肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)和轉(zhuǎn)錄等過程[1]。在多種腫瘤細(xì)胞中,FHL1表達(dá)水平降低并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1-2]。目前尚無針對FHL1與泌尿系腫瘤關(guān)系的報(bào)道,本文系統(tǒng)檢索并詳細(xì)回顧了FHL1與泌尿系腫瘤的相關(guān)研究并進(jìn)行綜述。

一、FHL1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

FHL蛋白家族是含有四個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白家族,歸屬于LIM蛋白的單純LIM蛋白亞類。人FHL蛋白家族由FHL1、FHL2、FHL3和FHL5四個(gè)成員構(gòu)成。FHL1基因位于X染色體q26.3處。LIM結(jié)構(gòu)域擁有一個(gè)高度保守的、功能性的雙鋅指域,其通過調(diào)節(jié)蛋白相互作用來參與肌動蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)和轉(zhuǎn)錄等過程[1]。在FHL1(也稱FHL1A)的兩個(gè)剪接變異體FHL1B和FHL1C中,既含有LIM結(jié)構(gòu)域又含有非LIM結(jié)構(gòu)域。目前FHL1的相關(guān)研究主要圍繞FHL1與肌肉疾病[1]、心血管疾病[3]和腫瘤的關(guān)系展開。在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中,FHL1的表達(dá)水平降低[2]。

二、FHL1與泌尿系腫瘤的關(guān)系

1.FHL1與腎細(xì)胞癌:Shen等[4]與Li等[5]采用免疫組化法檢測了9例人腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC)組織(病理類型不詳)及其配對癌旁正常腎組織中FHL1表達(dá)情況,結(jié)果顯示,9例癌旁正常腎組織中FHL1蛋白均有表達(dá),9例RCC組織中FHL1蛋白均無表達(dá);與癌旁正常腎組織比較,RCC組織中FHL1蛋白染色強(qiáng)度明顯降低(P≤0.001)。另外,他們采用免疫組化法檢測了無配對正常腎組織的50例RCC組織(病理類型不詳)中FHL1的表達(dá)情況,其中只有4例FHL1蛋白有表達(dá)。呂堯[6]通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中早期癌癥特異表達(dá)基因篩選研究發(fā)現(xiàn),在16例stageⅠ期腎乳頭狀細(xì)胞癌(papillary renal cell carcinoma, pRCC)患者(病理亞型不詳)樣本中,有54%患者的pRCC組織FHL1表達(dá)水平高于癌旁正常組織,平均表達(dá)差異倍數(shù)為14.6。

Yang等[7]采用Microarray法檢測了34例人pRCC組織的基因表達(dá)譜,來探索pRCC的分子亞型分類。該研究基于組織學(xué)特征和Fuhrman核分級系統(tǒng),將34例pRCC分為四個(gè)形態(tài)學(xué)亞型:1型14例,表現(xiàn)為低Fuhrman分級(≤2級)的小腫瘤細(xì)胞;2A型4例,表現(xiàn)為低Fuhrman分級(≤2級)的嗜酸性大腫瘤細(xì)胞;1型-2A型混合型5例;2B型11例,表現(xiàn)為高Fuhrman分級(≥3級)的嗜酸性大腫瘤細(xì)胞。該研究進(jìn)一步將四個(gè)pRCC形態(tài)學(xué)亞型歸為兩類pRCC分子亞型:第1類pRCC包括1型、2A型和1型-2A型混合型,第2類pRCC包括2B型。與第2類pRCC比較,第1類pRCC中FHL1的表達(dá)水平明顯升高;在第1類pRCC排名前10的高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本中,FHL1的轉(zhuǎn)錄本有4個(gè);可以只用7個(gè)轉(zhuǎn)錄本組合以97%的準(zhǔn)確率從分子水平有效區(qū)分第1類和第2類pRCC,7個(gè)轉(zhuǎn)錄本中有3個(gè)是FHL1的轉(zhuǎn)錄本。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對近端腎單位的形成至關(guān)重要[8],FHL1的剪接變體FHL1B(也稱KyoT3)和FLH1C(也稱KyoT2)是Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的有效抑制劑[9-10],Surendran等[11]通過基因敲除小鼠研究了Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎臟發(fā)育和腎臟腫瘤發(fā)生中的作用,結(jié)果顯示,抑制Notch信號會影響小鼠腎臟近端小管形成,導(dǎo)致小鼠腎臟近端小管中出現(xiàn)腎囊腫和腎乳頭狀微腺瘤;在上述研究中形成的囊腫囊壁上皮細(xì)胞中p21wAF1/Cip1(p21)表達(dá)缺失,在非囊性近端小管上皮細(xì)胞中p21表達(dá),提示p21表達(dá)缺失繼發(fā)于囊腫形成,而不是Notch信號缺失的直接后果;在Notch信號缺失小鼠的腎囊腫中,p21表達(dá)缺失可以促進(jìn)囊壁上皮細(xì)胞的增生。腎乳頭狀腺瘤被認(rèn)為是人pRCC的前體[12],Surendran等[11]進(jìn)一步分析了Yang等[7]的微陣列基因芯片(Microarray)數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在人第1類pRCC中,FHL1表達(dá)升高和Hey1表達(dá)降低之間存在顯著相關(guān)性,而Hey1是Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的靶點(diǎn),FHL1的剪接變體FHL1B和FLH1C是Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的有效抑制劑;同時(shí),他們采用免疫組化法檢測了FHL1B在6例人pRCC組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)FHL1B在4例第1類pRCC的細(xì)胞核中明顯表達(dá),在2例第2類pRCC和正常腎組織中表達(dá)缺失。他們的研究結(jié)果提示,Notch信號通路的抑制與人第1類pRCC的產(chǎn)生有關(guān),這與Notch信號缺失小鼠腎臟近端小管中腎乳頭狀微腺瘤的形成類似;FHL1及其剪接變體可能通過抑制Notch信號通路參與人第1類pRCC的產(chǎn)生。

Bratslavsky等[13-14]采用Microarray法檢測了美國國家癌癥研究所的11例希佩爾-林道(von Hippel-Lindau, VHL)綜合征患者的22個(gè)配對腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)病灶標(biāo)本,來比較同一個(gè)體的同一腎臟中長徑大于3 cm(大病灶)和長徑小于2 cm(小病灶)的ccRCC病灶間的基因表達(dá)差異。上述11例VHL綜合征患者分別在同一次手術(shù)中切除了同側(cè)腎臟的2個(gè)或2個(gè)以上的ccRCC病灶,每例患者至少有一個(gè)大病灶和一個(gè)小病灶以備選為配對ccRCC病灶標(biāo)本,同一患者入選配對的大、小病灶標(biāo)本的Fuhrman核分級相同,以求排除個(gè)體差異、病理差異對研究結(jié)果的影響。研究結(jié)果顯示,在VHL綜合征患者中,與長徑小于2 cm的相同核分級的ccRCC病灶比較,長徑大于3 cm的ccRCC病灶有65個(gè)差異表達(dá)基因,其中37個(gè)基因表達(dá)差異≥1.5倍(5個(gè)表達(dá)升高,32個(gè)表達(dá)降低);FHL1在長徑大于3 cm的ccRCC病灶和長徑小于2 cm的ccRCC病灶中表達(dá)水平差異明顯。

2.FHL1與前列腺癌(prostate cancer, PCa):Shen等[4]與Li等[5]采用免疫組化法檢測了9例人PCa組織及其配對癌旁正常前列腺組織中FHL1表達(dá)情況,結(jié)果顯示,2例PCa組織和6例癌旁正常前列腺組織中FHL1蛋白有表達(dá);9例PCa組織中FHL1蛋白染色強(qiáng)度明顯低于配對癌旁正常前列腺組織(P≤0.01)。另外,他們采用免疫組化法檢測了40例PCa組織中FHL1的表達(dá)情況,其中只有4例評分被判定為FHL1蛋白有表達(dá);與Gleason評分≤7分的17例PCa組織比較,Gleason評分≥8分的23例PCa組織中FHL1蛋白的表達(dá)例數(shù)(0.05

前列腺由胚胎泌尿生殖竇發(fā)育而來,泌尿生殖竇間充質(zhì)內(nèi)有一個(gè)明確的區(qū)域參與啟動和調(diào)節(jié)前列腺器官的發(fā)生,該區(qū)域被稱為腹側(cè)間充質(zhì)板(ventral mesenchymal pad, VMP)[15]。間充質(zhì)細(xì)胞可以參與器官形成和腫瘤發(fā)生。Vanpoucke等[16]采用基因表達(dá)序列分析技術(shù)(serial analysis of gene expression, SAGE)構(gòu)建了一個(gè)包含大鼠VMP細(xì)胞的SAGE文庫(VMP文庫)和一個(gè)包含大鼠所有前列腺前體細(xì)胞(VMP細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞)的SAGE文庫(VSU文庫),對比發(fā)現(xiàn)VMP文庫中FHL1基因表達(dá)水平明顯高于VSU文庫。基質(zhì)微環(huán)境在前列腺器官發(fā)生和腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用,癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)可以通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生[17]。Orr等[18]采用高通量測序技術(shù)(next-gen sequencing, NGS)對PCa患者的 CAFs、配對正常前列腺成纖維細(xì)胞(normal human prostate fibroblasts, NPFs)和意外終止妊娠后獲得的人胚胎前列腺組織細(xì)胞(embryonic prostate, EMB)進(jìn)行測序分析,結(jié)果顯示,3組細(xì)胞中FHL1基因表達(dá)水平為CAFs

Zhang等[19]采用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了人PCa高轉(zhuǎn)移性PC-3M-1E8細(xì)胞株和低轉(zhuǎn)移性PC-3M-2B4細(xì)胞株之間的蛋白表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),與低轉(zhuǎn)移性PC-3M-2B4細(xì)胞株相比,高轉(zhuǎn)移性PC-3M-1E8細(xì)胞株有28個(gè)蛋白表達(dá)水平明顯升高、30個(gè)蛋白表達(dá)水平明顯降低,其中FHL1蛋白表達(dá)水平降低最為明顯;生物信息學(xué)分析提示,上述差異蛋白主要參與肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、谷胱甘肽代謝、病毒致癌、造血等細(xì)胞通路,在蛋白相互作用分析中主要富集于基因表達(dá)、線粒體組構(gòu)、細(xì)胞骨架組構(gòu)、細(xì)胞遷移、上皮細(xì)胞間葉轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期和凋亡等過程;FHL1的mRNA水平和蛋白水平分別通過Western blotting法和實(shí)時(shí)定量PCR法在兩株細(xì)胞中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果與iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致,PC-3M-1E8細(xì)胞株FHL1蛋白和mRNA水平均明顯低于PC-3M-2B4細(xì)胞株。研究結(jié)果提示FHL1與PCa轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。

Verma等[20-21]將人PCa細(xì)胞系LNCaP和C4-2B暴露于20 μmol藥物濃度的恩雜魯胺(enzalutamide)6個(gè)月以上,獲得兩個(gè)恩雜魯胺耐藥細(xì)胞系(LNCaP ENZU和C4-2B ENZU),隨后采用高通量測序技術(shù)檢測LNCaP ENZU和C4-2B ENZU細(xì)胞系與各自親本細(xì)胞系(LNCaP和C4-2B)之間的基因表達(dá)差異并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與代謝重編程;與恩雜魯胺敏感的親本細(xì)胞系LNCaP相比,恩雜魯胺耐藥細(xì)胞系LNCaP ENZU中FHL1的mRNA水平升高10倍以上。研究結(jié)果提示FHL1與PCa耐藥相關(guān)。

3.FHL1與膀胱癌(bladder cancer, BCa):Matsumoto等[22]通過對比分析BCa組織和正常膀胱組織的基因表達(dá)差異、去甲基化試劑(5-aza-dC)處理前后BCa細(xì)胞的基因表達(dá)差異發(fā)現(xiàn),FHL1可能是BCa中的抑癌基因。他們進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)定量PCR法和實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR法(qMSP)檢測了70例人BCa組織和10例人正常膀胱組織中FHL1 mRNA的表達(dá)水平和甲基化程度,發(fā)現(xiàn)人BCa組織FHL1 mRNA的表達(dá)水平明顯低于正常膀胱組織,人BCa組織中FHL1的甲基化指數(shù)明顯高于正常膀胱組織;通過劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、二甲氧唑黃增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在BCa細(xì)胞株中過表達(dá)FHL1基因后,BCa細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯受到抑制,增殖能力無明顯影響。

Arum等[23]將同基因大鼠BCa細(xì)胞系(AY-27)接種于雌性Fischer大鼠膀胱內(nèi),建立原位大鼠BCa模型,用Microarray法檢測上述大鼠BCa組織和大鼠正常膀胱組織間的差異表達(dá)基因;同時(shí)分析了前人發(fā)表的3份人膀胱癌Microarray數(shù)據(jù),包含:①53例人BCa組織和5例人正常膀胱組織;②46例人BCa組織和9例人正常膀胱組織;③21例人BCa組織和4例人正常膀胱組織。他們的研究發(fā)現(xiàn),與各自的正常膀胱組織比較,人和大鼠的BCa組織中FHL1表達(dá)水平均明顯降低。

Zaravinos等[24]采用全基因組Microarray法分析了10例人BCa組織和5例人正常膀胱組織的基因表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)BCa組織中最活躍的染色體是9號染色體和X號染色體,X號染色體在正常膀胱組織中也具有高活躍度;BCa組織中,4、8、13、21、22和X號染色體的一些差異表達(dá)基因之間呈顯著線性相關(guān)(P<0.05),X號染色體上顯著線性相關(guān)的10個(gè)基因中包含F(xiàn)HL1;不同BCa組織樣本同一染色體的某些差異表達(dá)基因之間存在線性相關(guān)性,提示這些基因可能參與腫瘤進(jìn)展。

三、總結(jié)

目前FHL1在泌尿系腫瘤中的相關(guān)研究主要集中在RCC、PCa和BCa的部分病理類型中。FHL1在大多數(shù)PCa和BCa組織中低表達(dá),與PCa的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān),與BCa的遷移和侵襲相關(guān),參與腫瘤進(jìn)展,目前缺乏FHL1在PCa和BCa不同病理類型中的相關(guān)研究。不同病理類型的RCC組織中FHL1表達(dá)水平不同,不同pRCC亞型的FHL1表達(dá)水平不同,VHL綜合征患者不同長徑的ccRCC病灶中的FHL1表達(dá)水平不同,提示FHL1和RCC的關(guān)系復(fù)雜,有必要進(jìn)行更多的亞組分析。ccRCC和其他病理類型RCC的組織病理學(xué)表現(xiàn)和臨床預(yù)后不同。FHL1在不考慮病理類型的RCC樣本中低表達(dá),而在Fuhrman分級≤2級的pRCC樣本中高表達(dá),FHL1及其剪接變體可能通過抑制Notch信號通路參與低Fuhrman分級(≤2級)pRCC的產(chǎn)生。pRCC的預(yù)后和對現(xiàn)有酪氨酸激酶抑制劑類靶向藥物的反應(yīng)不同于ccRCC,pRCC組織中囊變、壞死、出血等較為常見,本綜述相關(guān)內(nèi)容為pRCC后續(xù)研究提供了有價(jià)值的指引和參考。

病理類型、病理形態(tài)學(xué)分級、臨床分期、病灶尺寸、FHL1及其剪接變體FHL1B和FLH1C的分別檢測等,是現(xiàn)有研究結(jié)果可靠性的潛在影響因素,也是未來研究方案設(shè)計(jì)中的考慮因素。