劉少杰，張金朝，王宇，王曉茹?

（1.諾達(dá)生物科技（贊皇）有限公司，河北石家莊 051230；2.石家莊學(xué)院，河北石家莊 050000）

隨著飼用微生態(tài)制劑無毒害、綠色、成本低、無耐藥性等優(yōu)點的突顯，現(xiàn)如今已成為養(yǎng)殖業(yè)的新星與研究熱點?；旌衔⑸镏苿┦菍⑷樗峋?、酵母菌等益生菌復(fù)配在一起而使得混合微生物制劑功效得以提高，混合微生物制劑越來越多的應(yīng)用于畜牧養(yǎng)業(yè)殖中。

為讓乳酸菌和酵母菌共培養(yǎng)時達(dá)到最佳生長狀態(tài)，本試驗先用同一培養(yǎng)基對兩株菌同時優(yōu)化，以便為后續(xù)兩株菌種的共培養(yǎng)提供條件基礎(chǔ)。再分別對乳酸菌和酵母菌在培養(yǎng)時間、轉(zhuǎn)速、初始pH 值、培養(yǎng)溫度等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，找出最適生長條件，最后在共培養(yǎng)階段對接種量進(jìn)行探索，以期為乳酸菌和酵母菌復(fù)配的混合微生物制劑的進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

乳酸菌、酵母菌由石家莊學(xué)院河北省高校微生物制藥應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心惠贈。

1.1.2 試劑

葡萄糖、硫酸錳、碳酸鈣、蛋白胨、硫酸鎂、牛肉膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸三銨、酵母膏、酵母浸粉、糖蜜、乙酸鈉。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

YPD 培養(yǎng)基：酵母膏10 克/升、葡萄糖20克/升、蛋白胨20 克/升。固體需加1%瓊脂粉。

MRS 培養(yǎng)基：牛肉膏8 克/升、葡萄糖20 克/升、蛋白胨10 克/升、酵母浸粉4 克/升、磷酸二氫鉀2 克/升、檸檬酸三銨2 克/升、乙酸鈉5 克/升、硫酸鎂0.2 克/升、硫酸錳0.05 克/升、吐溫80 1 毫升/升。固體需加1%瓊脂粉。

改良MRS 培養(yǎng)基：糖蜜28 克/升、酵母浸粉（工業(yè)用）14 克/升、磷酸二氫鉀2 克/升、檸檬酸三銨2 克/升、乙酸鈉5 克/升、硫酸鎂0.2 克/升、硫酸錳0.05 克/升、吐溫80 1 毫升/升。固體需加1%瓊脂粉。

培養(yǎng)基121℃高壓滅菌20 分鐘備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的復(fù)蘇與活化

在超凈工作臺中吸取10 微升凍存的乳酸菌，接種于1 毫升MRS 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 小時。無菌接種環(huán)蘸取菌液，在MRS 平板上劃線，37℃培養(yǎng)48 小時，待長出單菌落后，挑單菌落接種于MRS 液體培養(yǎng)基中活化備用。

酵母菌以同樣方法用YPD 培養(yǎng)基復(fù)蘇活化。

1.2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

將活化好的乳酸菌和酵母菌分別按1%接種量接種到原培養(yǎng)基和改良MRS 培養(yǎng)基中，37℃72 小時后，紫外分光光度計測得在600 納米處的吸光值并鏡檢觀察，確定在改良MRS 液體培養(yǎng)基中乳酸菌和酵母菌能否生長良好。

1.2.3 初始pH 值的確定

分別取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接種量接種于pH 值調(diào)到4、5、6、7、8 的滅菌改良MRS 培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)72 小時后測定吸光值。

1.2.4 培養(yǎng)溫度的確定

分別取活化后的乳酸菌和酵母菌按1%接種量接種于滅菌改良MRS 培養(yǎng)基中，設(shè)置不同溫度恒溫培養(yǎng)箱：28℃、30℃、37℃，其他培養(yǎng)條件相同，恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)72 小時后測定吸光值。

1.2.5 轉(zhuǎn)速的確定

分別取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接種量接種于滅菌改良MRS 培養(yǎng)基中，分別于轉(zhuǎn)速為0、50、100 和200 轉(zhuǎn)每分鐘條件下恒溫培養(yǎng)72 小時后測定吸光值。

1.2.6 培養(yǎng)時間的確定

分別取活化后的乳酸菌和酵母菌，按1%接種量接種于滅菌改良MRS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 小時、36 小時、48 小時、72 小時，隨后測定菌液吸光值，以得出最佳培養(yǎng)時間。

1.3 菌種接種方式的確定

1.3.1 乳酸菌和酵母菌分時接種

將活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接種量，在最適培養(yǎng)條件下進(jìn)行接種。先接種酵母菌，培養(yǎng)48 小時后接種乳酸菌，于最適培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)48 小時，測定吸光值。

將活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接種量，在最適培養(yǎng)條件下進(jìn)行接種。先接種乳酸菌，培養(yǎng)48 小時后接種酵母菌，于最適培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)48 小時，測定吸光值。

1.3.2 乳酸菌和酵母菌同時接種

將活化后的乳酸菌和酵母菌液按1%接種量，在最適培養(yǎng)條件下進(jìn)行接種。同時接種酵母菌和乳酸菌，培養(yǎng)48 小時，測定吸光值。

2 試驗結(jié)果

2.1 鏡檢形態(tài)

由乳酸菌鏡檢圖，可見短桿形或近球形且呈鏈狀排列的形態(tài)；由酵母菌鏡檢圖，可見大多為球型均勻分布的形態(tài)；由乳酸菌和酵母菌共培養(yǎng)時的菌株形態(tài)，可看到乳酸菌和酵母菌均勻分布于視野中。

2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

各菌株在原培養(yǎng)基和改良MRS 培養(yǎng)基中的培養(yǎng)菌液吸光值差異不太明顯，因改良MRS 培養(yǎng)基適用于工業(yè)生產(chǎn)且更價廉，所以改良后的培養(yǎng)基吸光值稍低，仍可以用改良MRS 作為基礎(chǔ)培基來培養(yǎng)乳酸菌和酵母菌。

2.3 初始pH 值的確定

乳酸菌和酵母菌在pH＜6 時，菌液濃度一直呈上升趨勢，而當(dāng)pH＞6 時，菌液濃度呈現(xiàn)下降趨勢，由此我們可以初步確定乳酸菌和酵母菌的最適pH 為6.0。

2.4 溫度的確定

乳酸菌吸光值隨溫度升高而變大，在28℃時吸光值最高；酵母菌吸光值隨溫度升高而降低，在37℃時吸光值最高。兩曲線交于36℃處，二者共培養(yǎng)時的最適溫度為36℃。

2.5 轉(zhuǎn)速的確定

乳酸菌吸光值在轉(zhuǎn)速0～100 轉(zhuǎn)時逐漸降低，轉(zhuǎn)速為0 吸光值最大，大于100 轉(zhuǎn)時又有上升趨勢；酵母菌吸光值在轉(zhuǎn)速為0～100 轉(zhuǎn)時很低，從轉(zhuǎn)速為100 轉(zhuǎn)時吸光值直線升高，在轉(zhuǎn)速為200 轉(zhuǎn)時吸光值最大。兩曲線相交于144 轉(zhuǎn)，因此二者共培養(yǎng)時的最適轉(zhuǎn)速為144 轉(zhuǎn)每分鐘。

2.6 培養(yǎng)時間的確定

乳酸菌培養(yǎng)時間在48 小時前，菌液濃度一直呈上升趨勢，而當(dāng)48 小時后，菌液濃度呈現(xiàn)下降趨勢，因此判定乳酸菌最佳培養(yǎng)時間為48小時；酵母菌隨培養(yǎng)時間的延長而菌量變大，因此共培養(yǎng)時的最佳培養(yǎng)時間為48 小時。

2.7 接種順序的確定

先接種乳酸菌，再接種酵母菌這種接種方式吸光值最高，即培養(yǎng)的菌濃最高，為接種方式的最佳選擇。

3 結(jié)論

本試驗研究表明改良MRS 培養(yǎng)基更適合于乳酸菌和酵母菌的工業(yè)生產(chǎn)，其中用于培養(yǎng)乳酸菌的最適培養(yǎng)條件為初始pH 值6.0，溫度37℃，培養(yǎng)時間48 小時，轉(zhuǎn)速為0，用于培養(yǎng)酵母菌的最適培養(yǎng)條件為初始pH 值6.0，溫度28℃，培養(yǎng)時間為72 小時，轉(zhuǎn)速200 轉(zhuǎn)每分鐘。乳酸菌和酵母菌共同培養(yǎng)時最佳培養(yǎng)條件為初始pH 值6.0，溫度36℃，培養(yǎng)時間為48 小時，轉(zhuǎn)速為144 轉(zhuǎn)每分鐘；乳酸菌和酵母菌共培養(yǎng)時接種方式的最佳選擇為先接種乳酸菌，再接種酵母菌。