王彩霞　蘭妍彥　孟衍樸等

關(guān)鍵詞 植物源農(nóng)藥；葡萄座腔菌；禾谷鐮孢；抑菌活性；毒力測定

中圖分類號：S 482.292 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022425

植物病害是導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量降低的重要原因之一，在植物病害中，由病原真菌引起的植物病害占70%～80%[1-2]。葡萄座腔菌Botryosphaeria do-thidea屬于葡萄座腔菌屬真菌，在世界各地廣泛分布，可以引起許多果樹病害，導(dǎo)致樹勢衰弱，果實產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重時整樹枯死，造成嚴重的危害和經(jīng)濟損失[1]；禾谷鐮孢Fusarium graminearum在生產(chǎn)中主要引起小麥赤霉病、玉米莖基腐病和穗腐病及水稻穗腐病[4-5]，不但造成作物產(chǎn)量損失，而且可以產(chǎn)生毒素，使作物品質(zhì)嚴重降低[6]。目前，對于這類病害的防治仍以化學(xué)防治為主，但化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，不僅污染了環(huán)境也使該類病原菌產(chǎn)生了抗藥性[7-8]，因此，研制針對該類病原菌的綠色農(nóng)藥迫在眉睫。植物源農(nóng)藥作為一種具有選擇性高、對非靶標生物安全、低毒環(huán)保、易于降解、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點的綠色農(nóng)藥，已成為植物病害防治的研究熱點之一[9-10]。

我國的藥用植物資源十分豐富，其種類超過1萬種，一些具有抑菌作用的藥用植物成分已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，其食用的安全性已得到充分證實，這為開發(fā)天然、安全、高效的植物源農(nóng)藥提供了理論基礎(chǔ)[11-13]。畢秀蓮等[14]通過對16種紅樹植物資源的篩選發(fā)現(xiàn)苦郎樹Volkameria znermis和苦檻藍Pentacoelium bontioides對甘蔗鳳梨病菌Cerato-cystis paradoxa和柑橘瘡痂病菌Elsinoe fewcetti具有較好的抑菌活性；周潔塵等[15]通過對13種植物資源的篩選發(fā)現(xiàn)垂序商陸Phytolacca americana和勝紅薊Ageratum conyzoides對膠孢炭疽菌Col-letotrichum gloeosporioides具有抑菌活性；張院民等[16]發(fā)現(xiàn)百部、虎杖和麥冬提取液對蘋果青霉菌Penicillium sp.的抑制效果最好，具有開發(fā)成新型植物源殺菌劑的潛質(zhì)。

本研究采用生長速率法評價了46科87種中藥植物乙醇提取物對葡萄座腔菌和禾谷鐮孢的抑菌活性；進一步測定高活性提取物的抑菌毒力和抑菌譜，以期篩選出較高抑菌活性的植物材料，為新型植物源殺菌劑的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試菌株

葡萄座腔菌、禾谷鐮孢、異旋孢腔菌Cochliobo-lus heterostrophus野生型和突變體以及擬輪枝鐮孢Fusarium verticillioides均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院提供。將菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，于（25±3）℃恒溫箱中，培養(yǎng)5d左右，保留備用。

1.1.2供試植物

供試植物87種，分屬于46科，購買于河北省安國市冷背藥材有限公司，具體見表1。供試植物放于密封袋內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3供試藥劑

90%代森錳鋅可濕性粉劑和98%多菌靈水分散粒劑購買自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2植物提取物的制備

采用超聲波提取法[17]提取植物樣品。加入無水乙醇，以料（g）：液（mL） =1：10進行提取，攪拌，每次30 min，共3次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液蒸干，得到濃度為100 mg／mL的樣品提取物，置于4℃冰箱，保存?zhèn)溆?，用于抑菌活性的測定。

1.3帶毒PDA培養(yǎng)基的制備

將馬鈴薯去皮切塊，加入1L蒸餾水，煮沸10～20 min，至用勺子可碾碎即可。用紗布過濾，加蒸餾水至1L。加入瓊脂和葡萄糖，加熱融化，分裝至錐形瓶中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。將一定量的植物乙醇提取物，用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，加0.1%的吐溫-80水溶液，定容成3 mL的100 mg/mL的藥液。分別移取0.3 mL植物提取物，加入15mL的已融化的PDA培養(yǎng)基中，搖勻。使帶毒培養(yǎng)基濃度為2 mg/mL，混合均勻倒入已滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻后即成帶毒的培養(yǎng)基平板。

1.4供試菌的培養(yǎng)

于無菌操作臺上，用打孔器打取直徑為0.65 cm菌餅，接種至PDA培養(yǎng)基中央，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h待用。

1.5抑菌活性的測定

1.5.1植物提取物對葡萄座腔菌和禾谷鐮孢的抑菌活性初步測定

采用生長速率法測定提取物的抑菌活性：待帶毒培養(yǎng)基凝固后，用無菌打孔器在已活化的菌落邊緣打取直徑為0.65 cm的菌餅，用無菌鑷子將菌餅接于上述帶毒PDA平板正中心，每個培養(yǎng)皿接1個菌餅，于（25±3）℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗倒置培養(yǎng)。待對照組的菌落直徑達培養(yǎng)皿直徑的80%以上時，即可測量結(jié)果。采用十字交叉法測定菌落直徑。每個處理3個重復(fù)，設(shè)置溶劑對照、空白對照和藥劑對照。

1.5.2高活性植物提取物的抑菌毒力測定

對抑菌活性較好的植物提取物進一步進行毒力測定：采用二倍稀釋法，將篩選出來的植物提取物稀釋為5個待測濃度，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，設(shè)置溶劑對照、空白對照和藥劑對照。

計算公式如下：

菌落直徑=測量直徑－菌餅直徑；

抑制率=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）／對照菌落直徑×100%。

1.6高活性植物提取物的抑菌譜測定

采用生長速率法測定高活性植物提取物對異旋孢腔菌（野生型）、擬輪枝鐮孢和異旋孢腔菌的抑菌活性。帶毒PDA培養(yǎng)基制備同1.3。將直徑6.5 mm的菌餅接入平板正中心，每個培養(yǎng)皿接入1個菌餅，每個處理3個重復(fù)，設(shè)置溶劑對照、空白對照和藥劑對照。待對照組的菌落直徑為培養(yǎng)皿直徑的80%以上時，測量各組的菌落直徑，計算抑制率。

1.7數(shù)據(jù)處理

相關(guān)試驗數(shù)據(jù)用Excel、SPSS 22.0等軟件分析?；貧w分析求出抑制中濃度（EC）、95%置信區(qū)間及毒力回歸方程等參數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1 87種植物乙醇提取物對葡萄座腔菌和禾谷鐮孢的抑菌活性

采用菌絲生長速率法測定了87種植物乙醇提取物對葡萄座腔菌和禾谷鐮孢的抑菌活性，結(jié)果見表1。在2mg/mL的供試濃度下，各植物乙醇提取物對葡萄座腔菌表現(xiàn)出不同的抑菌活性，其中，厚樸、麻葉蟛蜞菊、木蘭、細葉小檗、麥冬和絲瓜對葡萄座腔菌菌絲生長抑制效果較好，抑菌率達到50%以上，分別為95.80%、78.31%、54.65%、54.27%、52.59%、50.26%;白棠子樹、烏藥、秋子梨、郁李和葫蔓藤等抑菌率在40～6～50%之間，分別為47.84%、45.33%、44.02%、41.93%和40.70%。各植物乙醇提取物對禾谷鐮孢表現(xiàn)出不同的抑菌活性，其中，厚樸、麥冬、烏藥、絲瓜、桔梗（子實體）、桔梗（全株）和杜鵑蘭對禾谷鐮孢菌絲生長抑制效果較好，抑菌率分別為78.75%、66.52%，60.42%、59.81%、58.26%、57.39%、56.52%。郁李、紫萁、羅漢松、印度安息香、甘露子、榅槨、珊瑚菜、鐵皮石斛對禾谷鐮孢菌絲生長也具有一定的抑菌作用，抑制率在40%～50%。

2.2高活性植物乙醇提取物對葡萄座腔菌的抑菌毒力

進一步測定了厚樸和麻葉蟛蜞菊提取物對葡萄座腔菌菌絲生長的抑菌毒力（表2）。不同濃度麻葉蟛蜞菊提取物（0.25、0.5、1、2 mg／mL和4 mg／mL）對葡萄座腔菌均具有一定的抑菌效果（圖1），隨著處理濃度的增加，抑菌活性增強。處理96h后的ECo為1.57mg／mL。不同濃度厚樸提取物（0.04、0.08、0.16、0.32mg／mL和0.64 mg／ｍL）對葡萄座腔菌均具有一定的抑菌效果（圖2），隨著處理濃度的增加，抑菌活性增強，處理96 h后的ECo為0.10mg/mL。

2.3高活性植物乙醇提取物對禾谷鐮孢的抑菌毒力

進一步測定了厚樸、烏藥和麥冬提取物對禾谷鐮孢菌絲生長的抑菌毒力（表3）。不同濃度厚樸提取物（0.125、0.25、0.5、1mg／mL和2 mg/mL）對禾谷鐮孢均具有一定的抑菌效果（圖3），隨著處理濃度的增加，抑菌活性增強。處理96 h后的EC為0.45 mg／mL。不同濃度烏藥提取物（0.5、1、2、4 mg/mL和8 mg/mL）對禾谷鐮孢均具有一定的抑菌效果（圖4），隨著處理濃度的增加，抑菌活性增強。處理96 h后的EC為1.54 mg／mL。不同濃度麥冬提取物（0.5、1、2、4 mg／mL和8 mg/mL）對禾谷鐮孢均具有一定的抑菌效果（圖5），隨著處理濃度的增加，抑菌活性增強，處理96 h后的ECso為4.07 mg/mL。

2.4高活性植物提取物抑菌譜測定

選取高活性植物烏藥、麥冬、厚樸及麻葉蟛蜞菊提取物測定其抑菌譜，結(jié)果如表4所示。3種供試菌株在含藥平板（2 mg/mL）上培養(yǎng)96 h的結(jié)果顯示，4種植物提取物對3種供試菌株均有抑制作用，并且對于不同供試菌株的抑制率差異顯著。其中，厚樸、麻葉蟛蜞菊、烏藥及麥冬提取物對異旋孢腔菌野生型的抑菌率以及厚樸提取物對異旋孢腔菌的抑菌率均達到90%以上，厚樸、烏藥及麻葉蟛蜞菊對擬輪枝鐮孢的抑菌率在60%以上。

3結(jié)論與討論

本試驗選取了46科87種藥用植物開展抑菌活性研究，發(fā)現(xiàn)厚樸和麻葉蟛蜞菊對葡萄座腔菌菌絲生長抑制率較高，其中厚樸對葡萄座腔菌菌絲生長抑制率超過90%；厚樸、麥冬和烏藥對禾谷鐮孢菌絲生長抑制率較高，其中厚樸對禾谷鐮孢菌絲生長抑制率超過70%。抑菌譜測定結(jié)果表明，烏藥、麥冬、厚樸及麻葉蟛蜞菊提取物對異旋孢腔菌野生型的抑菌率以及厚樸提取物對異旋孢腔菌的抑菌率均達到90%以上。通過該研究篩選出了多種具有農(nóng)用抑菌活性的植物材料，因此，有必要加強對中藥植物抑菌活性篩選，以期為植物源殺菌劑的創(chuàng)制提供資源。

本研究發(fā)現(xiàn)，厚樸、麥冬、烏藥和麻葉蟛蜞菊等4種提取物對供試菌株表現(xiàn)出較強的抑制作用，具有進一步研究價值。厚樸是我國傳統(tǒng)中藥材，在醫(yī)藥和農(nóng)用活性方面均有報道[18]。在醫(yī)藥上，厚樸提取物對4種口腔致病菌的生長均具有較強的抑制作用，并具有抑制致齲菌形成和促進其瓦解的作用[19]；劉桂蘭等[20]的研究表明，厚樸總酚對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定的抗菌活性，最小抑菌濃度范圍為8～16μg/mL。在農(nóng)用活性研究方面，已發(fā)現(xiàn)厚樸提取物對馬鈴薯青枯病菌Ralstonia solanacearum的抑菌活性較好，最小抑菌濃度為0.1mg/mL[21]，并且已有研究表明厚樸酚及和厚樸酚為其主要抑菌成分[22]。麥冬為多年生常綠草本植物，其藥理功效收載于《中國藥典》中，主治健忘恍惚、肺燥干咳、津傷口渴等癥，具有抗心肌缺血、抗血栓、抗炎和抗腫瘤等多種活性[23-24]；此外，麥冬提取液對水稻紋枯病菌Thanatephorus cucumeris具有一定的抑制作用。烏藥為樟科植物烏藥的干燥塊根，具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、抑菌等生物學(xué)活性[25]。蟛蜞菊以全草或根人藥，味甘淡，微寒，清熱解毒，祛瘀消腫，主治白喉、百日咳、痢疾、跌打損傷等[26]。文獻查詢發(fā)現(xiàn)，除厚樸提取物外，麥冬、烏藥和麻葉蟛蜞菊等3種提取物的抑菌活性均未見系統(tǒng)研究，具有進一步開發(fā)的前景。

由此可見，厚樸、麥冬、烏藥和麻葉蟛蜞菊等4種植物的提取物具有較強的抑菌作用，對其進行系統(tǒng)深入地研究有望開發(fā)出新型植物源殺菌劑。