張海東　董懷玉　王麗娟等

關(guān)鍵詞 玉米；禾谷鐮孢；莖腐病；穗腐??；抗性鑒定

中圖分類號：S 435.131.49 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022196

玉米是我國主要的糧食和飼料作物，也是重要的工業(yè)原料和能源植物，自2012年以來，玉米播種面積超越水稻成為我國第一大糧食作物，在國民經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位，其生產(chǎn)的穩(wěn)定性和安全性直接影響我國糧食作物的生產(chǎn)安全和延伸產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。近年來隨著農(nóng)業(yè)種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和耕作栽培方式轉(zhuǎn)變、玉米品種更替以及全球性氣候變暖，玉米病蟲害發(fā)生呈持續(xù)加重趨勢，已成為制約玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素。特別是隨著全程機(jī)械化、秸稈還田、少免耕保護(hù)性耕作技術(shù)的推廣，玉米莖腐病、穗腐病等土傳病害已成為各玉米產(chǎn)區(qū)重大生產(chǎn)問題，也是治理和防控難點。據(jù)估測和統(tǒng)計，全球因病蟲害造成的玉米產(chǎn)量損失達(dá)19.5%～41.1%，控制玉米病蟲害對于保障玉米的安全生產(chǎn)具有十分重要的意義。而種植抗病或耐病品種是防控玉米莖腐病、穗腐病安全、經(jīng)濟(jì)和有效的根本措施，篩選優(yōu)異、穩(wěn)定的抗性種質(zhì)是成功選育抗、耐病玉米品種的基礎(chǔ)和必要手段[1-3]。育種與生產(chǎn)部門在進(jìn)行玉米抗性種質(zhì)鑒定過程中使用的鑒定評價方法各不相同，且抗性評價結(jié)果互有差異，尋找快速、準(zhǔn)確、簡便的鑒定評價方法，是進(jìn)行種質(zhì)資源抗病性鑒定的首要問題[4-6]。引起玉米莖腐病、穗腐病的病原菌種類比較多，已報道的病原菌種類均有20余種，國內(nèi)多數(shù)研究認(rèn)為其致病菌主要為鐮刀菌，其中禾谷鐮孢Fusarium graminearum為優(yōu)勢致病菌，侵染玉米不僅造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，且侵染玉米籽粒后產(chǎn)生的真菌毒素可對人畜健康造成嚴(yán)重威脅[7-9]。為此，本文對收集的92份玉米種質(zhì)分別采用不同的田間人工接種鑒定技術(shù)同步開展了玉米禾谷鐮孢莖腐病、穗腐病抗性鑒定接種方法比較試驗，篩選適宜北方春玉米產(chǎn)區(qū)玉米禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病抗性鑒定的最佳接種方法及抗性種質(zhì)，以期為促進(jìn)抗病種質(zhì)創(chuàng)新、抗病育種及生產(chǎn)上采取有效防病措施提供資源和依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試的玉米種質(zhì)共92份，均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供并保存，其中外引種質(zhì)51份，國內(nèi)常規(guī)種質(zhì)和自有改良創(chuàng)新種質(zhì)41份。玉米禾谷鐮孢莖腐病對照種質(zhì)為‘齊319’（抗?。┖汀?07'（感病），穗腐病對照品種為‘X178’（抗病）和‘B73’（感?。?。

供試的玉米莖腐病和穗腐病病原禾谷鐮孢菌株各1株，均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所采集遼寧玉米產(chǎn)區(qū)田間玉米莖腐病、穗腐病病害樣本經(jīng)單孢分離、純化培養(yǎng)而獲得的純培養(yǎng)物，經(jīng)致病力測定篩選的強(qiáng)致病力菌株。

1.2方法

1.2.1接種物制備

1.2.1.1莖腐病接種物繁殖

1）菌土覆蓋法和傷根法：將供試玉米莖腐病病原禾谷鐮孢菌株接種于滅菌的PDA平板上，于25℃下黑暗培養(yǎng)5～7d，待菌絲布滿PDA表面時，轉(zhuǎn)移接種于高壓滅菌的玉米粒培養(yǎng)基上（玉米粒浸泡24 h以上，煮th，涼后濾水裝入耐高溫高壓塑料袋中封口于121℃高壓滅菌th，冷卻備用），于生化培養(yǎng)箱中25℃黑暗培養(yǎng)擴(kuò)繁，待菌絲布滿玉米粒后即可用于接種。

2）莖節(jié)注射法：將供試菌株接種于滅菌的PDA平板上，于25℃下黑暗培養(yǎng)5～7d，待菌絲布滿PDA表面時，按每10皿培養(yǎng)物兌水700mL的比例，勻漿成糊狀，用于注射接種。

1.2.1.2穗腐病接種物繁殖

1）花絲通道法：將供試玉米穗腐病病原禾谷鐮孢菌株接種于高壓滅菌的SN低營養(yǎng)液體培養(yǎng)基（KHPO 1g，KCl 0.5g，KNO 1g，MgSO*7HO0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，加蒸餾水補(bǔ)足至11）中，于25℃下黑暗振蕩培養(yǎng)7～14d，可產(chǎn)生大量大型分生孢子，將培養(yǎng)液經(jīng)雙層滅菌紗布過濾，孢子懸浮液濃度調(diào)至2×10個/mL，即可用于接種。

2）雙牙簽法：將供試菌株接種于PDA平板上，于25℃下黑暗培養(yǎng)擴(kuò)繁4～5d，備用；選用木質(zhì)牙簽，水煮2～3次，每次煮th，煮后用清水沖洗2～3次，晾至半干后將牙簽用硫酸紙包好，高壓滅菌30 min，晾涼后平鋪于準(zhǔn)備好的PDA平板上，將擴(kuò)繁的病原菌接入鋪好牙簽的培養(yǎng)基四周，25℃下黑暗培養(yǎng)，使病原菌從培養(yǎng)基向牙簽上蔓延生長，經(jīng)10～14d，當(dāng)牙簽被病原菌覆蓋后，即可用于田間玉米接種。

1.2.2接種鑒定方法

病害鑒定圃設(shè)于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗基地內(nèi)。5月上旬播種，田間順序排列，每份種質(zhì)種植10行，行長5m，行距0.6 m，行留苗25株左右。每種人工接種鑒定方法接種2行，2次重復(fù)。

1.2.2.1莖腐病接種方法

1）菌土覆蓋法：田間接種與播種同步進(jìn)行，在供試材料播種前3～5 d，將擴(kuò)繁的玉米粒培養(yǎng)基接種物與過篩潮濕田園土按照1：4比例（質(zhì)量比）充分混拌制備成濃度為20%的菌土，覆膜保存?zhèn)溆谩２シN時采用穴播法播種玉米，先播種玉米種子，后將制備的菌土100g／穴覆蓋在玉米種子上覆土、鎮(zhèn)壓。

2）傷根法：在玉米抽雄初期進(jìn)行，將玉米根系一側(cè)土壤扒開，將病原菌培養(yǎng)物20～30g撒在露出的根系處并覆土。接種后及時進(jìn)行一次田間澆水，保證病原菌侵染需要的土壤濕度條件。

3）莖節(jié)注射法：在玉米植株散粉后3～5 d進(jìn)行，在植株靠近地表的第2莖節(jié)中部，用電鉆以45度角斜向下打孔至莖髓部，利用注射器將1.0 mL制備的接種菌液直接注入玉米植株莖髓中，用凡士林封洞。接種后田間澆水1次，此后進(jìn)行正常肥水管理。

1.2.2.2穗腐病接種方法

1）花絲通道法：在玉米果穗吐絲授粉3～5 d后，利用注射器，從果穗花絲部位將制備好的孢子懸浮液注入果穗，每穗注射接種2 mL。接種后正常肥水管理。

2）雙牙簽法：在玉米果穗吐絲后14～21 d，花絲已完全萎蔫為接種適期。選擇適宜接種果穗，先在果穗中部用大號注射針頭穿洞，深度達(dá)果穗穗軸中心為宜，防止直接用牙簽插入時附著在牙簽上的病原菌脫落，然后將帶菌牙簽2根并排插入果穗接孔中。接種后正常肥水管理。

1.2.3抗性評價方法

田間抗性評價均于9月中旬玉米進(jìn)入乳熟后期進(jìn)行。

玉米禾谷鐮孢莖腐病莖節(jié)注射法調(diào)查時，先砍除莖稈上部節(jié)段，留地上莖4～5節(jié)，用快刀縱剖莖稈，從縱剖面查看莖稈中莖髓部變色的病斑區(qū)域大小。逐株調(diào)查莖髓部發(fā)病面積，記載病情級別（表1），計算平均病情級別并依據(jù)其確定供試種質(zhì)對玉米莖腐病的抗性水平，抗性評價標(biāo)準(zhǔn)見表2[10]。傷根法和菌土覆蓋法調(diào)查時逐株調(diào)查每份鑒定種質(zhì)的發(fā)病狀況。剝開近地面玉米葉片，著重調(diào)查莖基部節(jié)位，莖節(jié)或節(jié)間變褐色或黑褐色，莖節(jié)變軟，剖開髓部可見髓部空松，顏色變深，即為發(fā)病株。調(diào)查記載總株數(shù)和發(fā)病株數(shù)，計算發(fā)病株率，以群體發(fā)病率確定其對玉米莖腐病的抗性水平，抗性評價標(biāo)準(zhǔn)見表2[11]。

玉米禾谷鐮孢穗腐病調(diào)查時將接種玉米果穗剝?nèi)グ~，逐個調(diào)查記載果穗病情級別：1級：發(fā)病面積占果穗總面積0%～1%；3級：發(fā)病面積占果穗總面積2%～10%；5級：發(fā)病面積占果穗總面積11%～25%；7級：發(fā)病面積占果穗總面積26%～50%；9級：發(fā)病面積占果穗總面積51%～100%。計算平均病情級別，確定供試種質(zhì)對玉米穗腐病的抗性水平，抗性評價標(biāo)準(zhǔn)見表2[12-13]。

2結(jié)果與分析

2.1莖腐病3種接種鑒定方法的抗性評價結(jié)果比較

統(tǒng)計分析玉米禾谷鐮孢莖腐病3種接種鑒定方法的抗性評價結(jié)果（圖1）可知：3種接種方法的發(fā)病（發(fā)病率或病情級別）嚴(yán)重度依次為莖節(jié)注射法>菌土覆蓋法>傷根法，鑒定評價表現(xiàn)中抗以上的抗性種質(zhì)材料分別為20份、56份和67份，占供試玉米種質(zhì)總數(shù)的21.74%、60.87%和72.83%；其中莖節(jié)注射法鑒定出的抗性種質(zhì)以中抗為主，未見表現(xiàn)高抗的材料；而菌土覆蓋法和傷根法鑒定出的抗性種質(zhì)均以高抗為主，中抗次之，表現(xiàn)抗性的材料極少或沒有，表明莖節(jié)注射法可更好地鑒定出抗莖腐病的玉米種質(zhì)，其次為菌土覆蓋法。

2.2穗腐病2種接種鑒定方法的抗性評價結(jié)果比較

從玉米禾谷鐮孢穗腐病2種鑒定方法的抗性評價結(jié)果（圖2）可知，不同接種方法的發(fā)病嚴(yán)重度依次為雙牙簽法>花絲通道法，其中雙牙簽法鑒定中表現(xiàn)中抗及以上的抗性種質(zhì)分別為2份（HR）、33份（R）和34份（MR），分別占供試種質(zhì)的2.17%、35.87%和36.96%；花絲通道法鑒定中表現(xiàn)中抗及以上的抗性種質(zhì)分別為2份（HR）、56份（R）和27份（MR），分別占供試種質(zhì)的2.17%、60.87%和29.35%。表明雙牙簽法能更好地鑒定評價玉米種質(zhì)對穗腐病的抗病性水平。

2.3抗性玉米種質(zhì)鑒選

通過不同的接種方法對92份玉米種質(zhì)進(jìn)行了2種禾谷鐮孢病害的田間抗性鑒定，分別篩選出了一批抗性種質(zhì)，但不同的接種鑒定方法篩選出的抗性種質(zhì)有差異。

玉米穗腐病抗性鑒定中‘鐵0270’‘W240’‘9539‘CG109’和‘F1803’等66份材料在2種接種方法中均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，占供試玉米種質(zhì)的71.74%（表3）。

玉米莖腐病3種接種鑒定方法分別鑒選出的抗性種質(zhì)（表4）中僅有‘鐵0203’‘鐵0255-1’‘F886’‘9502’‘9556’‘9578’‘LP4-1’‘NET165’‘W382'等9份材料在3種接種方法中均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，只占供試玉米種質(zhì)的9.78%；而菌土覆蓋法和傷根法分別鑒選出的抗性種質(zhì)中有‘9407’‘W360’‘鐵0203’和‘N510’等52份材料在2種鑒定方法中均表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，占供試種質(zhì)的56.52%。

菌土覆蓋法和傷根法鑒定篩選出的對莖腐病均表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的52份種質(zhì)和穗腐病2種接種方法篩選出的表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的66份種質(zhì)中，有33份種質(zhì)兼抗禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病，占供試種質(zhì)的35.87%（表5）。

3結(jié)論與討論

本研究通過田間人工接種試驗對92份玉米種質(zhì)同步進(jìn)行了禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病不同接種鑒定方法的抗性評價與篩選，明確東北春玉米產(chǎn)區(qū)玉米禾谷鐮孢莖腐病、穗腐病抗性鑒定的最佳接種方法。禾谷鐮孢莖腐病3種接種鑒定方法中莖節(jié)注射法鑒選出的抗性種質(zhì)數(shù)量最少，原因可能是其人為機(jī)械損傷莖部韌皮組織后病菌在莖部髓組織內(nèi)擴(kuò)展，僅反映莖部髓組織致病菌擴(kuò)展的情況，忽略了玉米植株莖稈韌皮組織的物理抗性水平所致[14]；而菌土覆蓋法和傷根法更接近田間自然侵染規(guī)律，鑒定評價出的抗性種質(zhì)包含玉米植株莖稈韌皮組織的物理抗性，同時，綜合考慮接種鑒定技術(shù)的實用性和可操作性，采用菌土覆蓋法對大體量種質(zhì)資源進(jìn)行田間抗病性鑒定可能更具有優(yōu)勢，而莖節(jié)注射法在精準(zhǔn)鑒定中可更好地評價玉米種質(zhì)的抗病性。禾谷鐮孢穗腐病2種接種鑒定方法中雙牙簽法在種質(zhì)接種后發(fā)病的嚴(yán)重度、田間進(jìn)行接種的可操作性和實用性方面均優(yōu)于花絲通道法。本研究篩選出一批對2種病害表現(xiàn)抗性穩(wěn)定的單抗或兼抗種質(zhì)，這些抗性種質(zhì)將對我國玉米抗病育種和豐富我國玉米禾谷鐮孢莖腐病、穗腐病抗性基因的遺傳基礎(chǔ)具有重要的利用價值[15-17]。

近年來，我國玉米耕作栽培措施有了很大的變革，密植栽培、秸稈還田、少免耕等保護(hù)性耕作栽培技術(shù)得到大力推廣應(yīng)用。密植栽培在提高玉米產(chǎn)量的同時，也增加了玉米的抗性負(fù)擔(dān)，而秸稈還田和免耕技術(shù)與玉米病害之間的關(guān)系十分密切，秸稈覆蓋還田后會增加病菌基數(shù)，增加病害的發(fā)生概率，使玉米病害發(fā)生流行呈現(xiàn)多變性，尤其玉米莖腐病，穗腐病等土傳病害發(fā)生危害逐年加重，且生產(chǎn)上推廣的一些玉米品種對莖腐病、穗腐病抗性多在中抗水平及以下；即使是抗性品種，多年連作后也可導(dǎo)致病害的嚴(yán)重發(fā)生[18-19]。同時玉米因其植株高大，莖腐病、穗腐病等土傳病害多在生育后期呈現(xiàn)發(fā)病高峰，田間防控措施難以實施。由此導(dǎo)致以莖腐病、穗腐病為主的土傳病害成為當(dāng)前和未來玉米病害發(fā)生的重點及治理、防控難點，必將成為各玉米產(chǎn)區(qū)的重大生產(chǎn)問題。田間病害發(fā)生情況調(diào)查表明，不同玉米品種或種質(zhì)資源對莖腐病的抗性存在顯著差異，抗病品種具有明顯降低病害發(fā)生率、減輕產(chǎn)量損失的作用。對玉米生育后期的土傳病害的治理目前尚無有效單一的防控措施，綜合防治以推廣種植抗病品種為主，輔以農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治及生物防治等多項措施并舉的治理方案[20-22]，其中栽培玉米抗性品種占目前防治方式的43%[23]。優(yōu)異的抗性種質(zhì)是進(jìn)行抗病品種選育的前提和基礎(chǔ)，適宜的接種鑒定方法則是挖掘抗性種質(zhì)的必要手段。今后玉米莖腐病、穗腐病等土傳病害研究重點應(yīng)搜集、挖掘和鑒定玉米種質(zhì)資源，拓展抗性種質(zhì)，加大其利用途徑，為抗病育種提供新的抗源；避免現(xiàn)有抗性種質(zhì)資源比較豐富，而育種相對不足的狀況；將挖掘到的抗病基因，特別是多抗基因通過生物技術(shù)轉(zhuǎn)入到感病優(yōu)異種質(zhì)或品種中進(jìn)行創(chuàng)新改良，為選育抗病品種奠定材料基礎(chǔ)[24]；篩選功能菌株研制生防制劑和采取農(nóng)業(yè)綜合栽培措施等綠色防控技術(shù)。