張夢(mèng)娜　楊云　王立平等

關(guān)鍵詞 農(nóng)藥殘留；柑橘；草甘膦；代謝物

中圖分類(lèi)號(hào)：S 481.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022319

柑橘是我國(guó)種植面積大、產(chǎn)量高的水果之一，其農(nóng)藥殘留問(wèn)題一直被公眾廣泛關(guān)注。草甘膦（glyphosate）是由美國(guó)孟山都公司開(kāi)發(fā)的一種內(nèi)吸廣譜型非選擇性除草劑，其除草機(jī)制主要是通過(guò)抑制植物體內(nèi)的烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶，從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉(zhuǎn)化，使蛋白質(zhì)合成受到干擾，導(dǎo)致植株死亡，對(duì)多年生深根雜草的地下組織破壞力很強(qiáng)[1-3]。草甘膦因其具有高效、低毒的特點(diǎn)已成為我國(guó)柑橘園用量最大、使用頻次最高的除草劑[4]。目前，我國(guó)已有362個(gè)草甘膦制劑產(chǎn)品在柑橘上取得了登記。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2021）規(guī)定草甘膦在柑、橘、橙中的最大殘留限量為0.5 mg/kg。草甘膦在我國(guó)植物源性食品中的殘留物定義和膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義分別為草甘膦和草甘膦與氨甲基膦酸（AMPA）之和，以草甘膦表示。隨著耐草甘膦轉(zhuǎn)基因作物在全球推廣種植，2013年世界糧農(nóng)組織／世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥殘留聯(lián)合專(zhuān)家會(huì)議（Joint Meeting on Pesticide Residues）根據(jù)草甘膦在轉(zhuǎn)基因作物中的代謝試驗(yàn)結(jié)果將其在玉米、大豆、油菜中的殘留物定義修改為草甘膦與N-乙酰草甘膦之和，以草甘膦表示，并將草甘膦在植物源性和動(dòng)物源性食品中膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義修改為草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA之和，以草甘膦表示[5]。2016年，歐洲食品安全局（EFSA）提議將草甘膦在所有植物源性食品中的殘留物定義修改為草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA之和，以草甘膦表示，并將其膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估定義修改為草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA之和，以草甘膦表示[6]。隨著草甘膦的大量、長(zhǎng)期使用，較多的草甘膦直接進(jìn)入土壤或通過(guò)飄移進(jìn)入水體和大氣而污染環(huán)境，同時(shí)在植物中殘留的草甘膦及其代謝物通過(guò)食物鏈對(duì)動(dòng)物和人體產(chǎn)生潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。2017年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將草甘膦歸類(lèi)為2A類(lèi)致癌物，即很可能對(duì)人類(lèi)致癌，并對(duì)草甘膦在食品中的殘留進(jìn)行嚴(yán)格管控[3]。因此，建立一種快速、穩(wěn)定且靈敏度高的草甘膦及其代謝物在柑橘中的殘留檢測(cè)方法具有重要意義。

草甘膦及其代謝物屬于強(qiáng)極性化合物，極易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，同時(shí)其分子結(jié)構(gòu)中不含有發(fā)色和熒光基團(tuán)，從食品中提取、檢測(cè)難度較大。目前草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫檢測(cè)法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]。其中，毛細(xì)管電泳法和離子色譜法具有簡(jiǎn)單快速的優(yōu)勢(shì)，但其方法定量限不能滿(mǎn)足殘留分析方法的要求。色質(zhì)聯(lián)用因其具有較高的靈敏度，在草甘膦的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，但在前處理過(guò)程中均需衍生化，步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，且反應(yīng)條件難以控制，無(wú)法滿(mǎn)足大量樣品的快速檢測(cè)[9]。

本研究結(jié)合陰離子分離色譜柱，并通過(guò)對(duì)前處理方法和色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化，首次建立了一種基于反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)柑橘中草甘膦及其代謝物N-乙酰草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需衍生化，為植物源食品中草甘膦及其代謝物的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)提供了方法借鑒。

1材料與方法

1.1藥劑與試劑

草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品（CAS： 1071-83-6，99.3%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；N-乙酰草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品（CAS： 129660-96-4，99.3%），中國(guó)天津阿爾塔科技有限公司；氨甲基磷酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：1066-51-9，98%），美國(guó)Worcester公司；N-乙酰氨甲基磷酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS： 57637-97-5，純品，96.7%），美國(guó)Worcester公司；乙腈（分析純）、甲醇（分析純）、甲酸（分析純）從北京精細(xì)化工有限公司購(gòu)得；N-丙基乙二胺（PSA，40μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C，40μm）和石墨化炭黑（GCB，40μm）等分散劑均從天津博納艾杰爾科技有限公司購(gòu)得；超純水由Milli-Q（Bedford，MA，美國(guó)）制得。

1.2儀器設(shè)備

檢測(cè)儀器為AB SCIEX4500高效液相色譜質(zhì)譜儀（Triple Quad 4500型），Triple QXW-80A渦旋混合器，Scientific industries，美國(guó)；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；SIGMA 1-15離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；G501A型電子天平（精確度0.1g），江蘇常熟衡器廠；電子分析天平（精確度0.0001g），德國(guó)Sartorious公司；醫(yī)用無(wú)菌注射器，上海治宇醫(yī)療器械有限公司；微孔Filter Unit濾膜（有機(jī)相，0.22μm），MILLEX-GV，美國(guó)密理博公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

柑橘樣品（果肉、全果）經(jīng)勻漿機(jī)均質(zhì)后稱(chēng)取2g試樣（精確至0.1g）至50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入20 mL 0.5%甲酸水，劇烈振蕩10 min，超聲5min后以4000r/min離心5min，吸取1.5 mL的上清液至2mL已加入40mg C的塑料離心管中，渦旋混勻1min，以10000r／min離心5min，經(jīng)0.22μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣小瓶中待測(cè)。

1.3.2色譜-質(zhì)譜檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為Metrosep A Supp 5 col-umn （4.0 mm×150 mm，5μm，Metrohm公司）；進(jìn)樣量50μL，流速0.6 mL／min;柱溫40℃；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為200 mmol／L碳酸氫銨溶液（含0.1%氨水）；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式；氣簾氣：35 psi；離子化電壓：－4500 V;源溫度600℃；噴霧氣：55 psi；輔助加熱氣：45 psi；數(shù)據(jù)采集采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2結(jié)果與分析

2.1提取劑的選擇

在QuEChERS方法中，乙腈作為最常用的提取劑，具有優(yōu)良的溶劑性能，能溶解多種有機(jī)、無(wú)機(jī)和氣體物質(zhì)；甲醇溶解性好、滲透強(qiáng)，也是農(nóng)產(chǎn)品基質(zhì)中常用的提取溶劑之一。本研究考慮到目標(biāo)化合物的親水性質(zhì)，采用水、甲醇-水體系、乙腈-水體系進(jìn)行提取效果的優(yōu)化，提取液總體積為20 mL，混合提取液水和甲醇體積比為1：1，水和乙腈體積比為8：2；其他前處理?xiàng)l件保持一致。結(jié)果如圖1所示，對(duì)于柑橘全果而言，采用乙腈-水體系提取草甘膦的回收率為130%，不滿(mǎn)足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T788-2018）添加水平為0.01～0.1mg/kg時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率為70%～120%的要求；而水或甲醇-水作為提取液時(shí)，草甘膦及其代謝物回收率均在70%～110%，說(shuō)明水和甲醇一水體系提取均滿(mǎn)足回收率要求，且回收率之間差異不明顯；由于水作為提取劑具有經(jīng)濟(jì)成本低、環(huán)境相容性好及試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便快捷等特點(diǎn)，所以在后續(xù)試驗(yàn)中采用水作為提取劑。在提取液中加入適量甲酸可以使酸性化合物呈現(xiàn)分子態(tài)，進(jìn)而增加其在提取劑中的溶解性，本研究比較了水、0.5%甲酸水、1%甲酸水及2%甲酸水的提取效果，結(jié)果如圖2所示，隨著甲酸濃度的增加柑橘全果中N-乙酰草甘膦回收率逐漸升高，且當(dāng)甲酸濃度大于0.5%時(shí)，N-乙酰草甘膦回收率超過(guò)110%；而在柑橘果肉中，隨著甲酸濃度的增加4種目標(biāo)物的回收率基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且甲酸濃度為0.5%時(shí)提取效果最好。所以，最終選取0.5%甲酸水作為提取劑。

2.2凈化劑的選擇

在農(nóng)藥殘留分析中常用的凈化劑有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C）及石墨化炭黑（GCB）。PSA可以有效去除脂肪酸、有機(jī)酸和一些極性色素及糖類(lèi)物質(zhì)；C主要去除一些非極性組分；GCB主要吸附一些具有平面結(jié)構(gòu)的化合物，如色素等。柑橘全果和果肉中有機(jī)酸、糖類(lèi)、色素含量較高，容易對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，本研究對(duì)50 mg PSA（T1）、50 mg C18 （T2）、20 mgGCB（T3）以及40 mg PSA+10 mg GCB（T4）、40 mg C+10 mg GCB（T5）5種凈化劑進(jìn)行了凈化效果對(duì)比。經(jīng)5種方式凈化后，提取液的上清液均變澄清，說(shuō)明5種凈化方式都能很好地去除色素。如圖3所示，使用PSA作為凈化劑時(shí)，草甘膦、N-乙酰草甘膦及N-乙酰AMPA回收率均低于50%，主要是由于PSA在吸附雜質(zhì)的同時(shí)，也對(duì)強(qiáng)極性的草甘膦及其代謝物有較強(qiáng)的吸附作用，導(dǎo)致回收率不能滿(mǎn)足要求；單獨(dú)使用GCB時(shí)柑橘全果中4種目標(biāo)化合物的回收率均大于120%，使用C18+GCB組合作為凈化劑時(shí)柑橘果肉中3種目標(biāo)化合物的回收率大于120%，不滿(mǎn)足《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T788-2018）要求；單獨(dú)使用C進(jìn)行凈化時(shí)，柑橘全果和果肉中4種目標(biāo)化合物回收率均在70%～110%，滿(mǎn)足回收率的要求。所以，最終選取采用40 mg C18作為凈化劑對(duì)提取液進(jìn)行凈化。

2.3方法驗(yàn)證

2.3.1線性關(guān)系

用超純水和柑橘全果及果肉空白基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x，mg/kg）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表3所示，在0.05～1mg/kg范圍內(nèi)，本方法線性回歸相關(guān)系數(shù)R均大于0.99，線性關(guān)系良好。

2.3.2基質(zhì)效應(yīng)分析

影響基質(zhì)效應(yīng)的因素有很多，基質(zhì)類(lèi)型、化合物的理化性質(zhì)以及樣品前處理過(guò)程均可對(duì)基質(zhì)效應(yīng)造成影響。基質(zhì)效應(yīng)的存在會(huì)影響殘留農(nóng)藥的準(zhǔn)確定量分析，通過(guò)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值，可以判斷基質(zhì)效應(yīng)的大小[11]。即當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在±20%之間時(shí)，被認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較低；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在±50%之間時(shí)，被認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)中等；當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)超出±50%時(shí)，被認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)[12]。如表3所示，柑橘果肉和全果對(duì)草甘膦及其代謝物存在不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)和減弱效應(yīng)，其中草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA在果肉和全果中的基質(zhì)效應(yīng)在－22.9%～20.2%，表明存在較弱的基質(zhì)效應(yīng)，可以忽略；而AMPA在柑橘果肉和全果中的基質(zhì)效應(yīng)分別為68.6%和72.0%，表明存在較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)作用，采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液定量可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏高。因此，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了補(bǔ)償，以提高定量準(zhǔn)確性[13]。

2.3.3回收率和定量限

在空白柑橘全果和果肉樣品中添加0.05mg/kg（檢測(cè)方法能夠穩(wěn)定測(cè)定的最小值），0.5 mg/kg（MRL值），1.0mg/kg（涵蓋樣品中可能的最大值）3個(gè)不同水平的4種混合目標(biāo)物，每個(gè)加標(biāo)水平設(shè)5個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明（表4），柑橘全果中草甘膦及其3種代謝物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率范圍為70.5%～109.5%，RSD為3.2%～10.1%，柑橘果肉中草甘膦及其3種代謝物在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率范圍為73.9%～103.0%，RSD為0.6%～7.9%，滿(mǎn)足殘留分析方法的要求，相關(guān)譜圖見(jiàn)圖4。

2.4實(shí)際樣品檢測(cè)

將在北京超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的柑橘，按上述方法進(jìn)行前處理和檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草甘膦及其代謝物在柑橘全果和果肉中均未檢出。

3結(jié)論

首次建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定草甘膦及其代謝物N-乙酰草甘膦、氨甲基磷酸（AMPA）和N-乙酰AM-PA在柑橘中的殘留檢測(cè)方法。草甘膦及其代謝物可在7min內(nèi)完成分離檢測(cè)，在0.05～1 mg/kg濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；樣品經(jīng)過(guò)0.5%甲酸水提取，十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（C）凈化，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償，草甘膦及其代謝物在柑橘中的回收率在70.5%～109.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.6%～10.1%，最低檢測(cè)濃度（LOQ）為0.05mg/kg。與傳統(tǒng)方法相比，該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確可靠、無(wú)需衍生化，可滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留分析的要求，并可用于大量樣品的快速檢測(cè)。