張大琪　任立瑞　杜洪志等

關(guān)鍵詞 哈茨木霉； 淡紫擬青霉； 枯草芽胞桿菌； 土壤微生物； 宏基因組學(xué)； 有益菌

中圖分類號： Ｓ１４４．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２２２３

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展改變了作物的種植方式，許多高附加值作物的種植規(guī)模也逐漸擴(kuò)大，作物連作的種植模式可提高農(nóng)戶的經(jīng)濟(jì)收入，但高附加值作物的連年種植會產(chǎn)生一系列問題，如土壤酸化、土壤微生物功能結(jié)構(gòu)劣變等［１］。此外，長期在同一塊土地種植同一種作物也加劇了土傳病害的發(fā)生和發(fā)展，易造成高附加值作物減產(chǎn)甚至絕收［２］。生姜作為高附加值經(jīng)濟(jì)作物在中國廣泛種植，２０２０年中國生姜種植面積達(dá)５９７５２ｈｍ，全國生姜產(chǎn)量約為６４１２萬ｔ［３］。生姜連作的種植模式在中國較為常見。生姜種植過程中常遭遇土傳病害的侵染，其中由青枯雷爾氏菌Ralstonia solanacearum引起的姜瘟病可導(dǎo)致生姜當(dāng)茬絕收，并且其危害可延續(xù)多年，生姜姜瘟病已經(jīng)成為限制生姜發(fā)展的瓶頸［４］。另外，一些病原真菌導(dǎo)致的生姜病害也正阻礙著生姜的健康生長，其中較為嚴(yán)重的是生姜莖基腐病，又稱爛脖子病，其主要致病菌為尖鐮孢Fusarium oxys-porum［５］。

土壤是作物生長、獲取營養(yǎng)元素的大本營，微生物是土壤中最龐大的群體之一，直接或間接參與土壤介質(zhì)中的一切活動。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性是評價土壤健康的指標(biāo)之一。土壤中有益微生物數(shù)量較多時，土壤質(zhì)量就會變優(yōu)，而大量致病菌占據(jù)土壤空間時，土壤就會成為“病土”。因此如何長久有效地調(diào)節(jié)土壤中有益微生物的數(shù)量也成了當(dāng)今農(nóng)業(yè)科研領(lǐng)域亟須解決的問題。

微生物菌劑是將有益的活性菌經(jīng)過特殊的加工工藝制成便于使用的生物制劑或活菌制劑［６］。目前微生物菌劑主要有細(xì)菌類菌劑（芽胞桿菌、假單胞菌、根瘤菌）、真菌類菌劑（木霉、淡紫擬青霉、菌根真菌）和病毒類菌劑（核型多角體病毒）。研究表明，微生物菌劑能夠增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量［７］，提高作物對礦物元素的吸收，抑制病原菌的發(fā)生，增強(qiáng)作物對病害的抵抗力并提高作物的產(chǎn)量［８９］。劉麗英等［１０］的研究表明，經(jīng)枯草芽胞桿菌ＳＮＢ-８６菌劑處理的土壤種植平邑甜茶幼苗，土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量顯著增加，真菌的數(shù)量降低，并且促進(jìn)了幼苗的生長。Ｓｈｅｎ等［１１］研究表明，生物菌劑可降低香蕉枯萎病的發(fā)病率。張蕾等［１２］研究表明，土壤調(diào)理劑配施微生物菌劑（成分：枯草芽胞桿菌、側(cè)孢短芽胞桿菌、植物乳酸菌等高活性有益菌群）處理黃瓜土壤后顯著改善了土壤理化性質(zhì)，降低了土壤表層的鹽分含量，增加了土壤中有益菌群的含量，并促進(jìn)了黃瓜的生長。工業(yè)和信息化部在２０１５年頒布的《關(guān)于推進(jìn)化肥行業(yè)轉(zhuǎn)型發(fā)展的指導(dǎo)意見》中提出力爭在２０２０年將我國新型肥料的使用量提升至化肥總體用量的３０％［１３］。其中微生物菌劑作為新型肥料的主要產(chǎn)品之一，其研發(fā)力度和使用量不斷加大，具有較大的發(fā)展?jié)摿涂臻g，已成為國內(nèi)外的研發(fā)熱點(diǎn)。目前，關(guān)于微生物菌劑的研究多集中在設(shè)施蔬菜中，對于高附加值經(jīng)濟(jì)作物特別是根莖類經(jīng)濟(jì)作物的研究較少。

本試驗(yàn)在生姜連作地塊中澆灌富含哈茨木霉Trucgiderna garzianumＴＨ７、淡紫擬青霉Pur-pureocillium lilacinum ＰＬ２２以及高效枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的微生物菌劑（商品名：綠地成金），并通過微生物分離培養(yǎng)和宏基因組測序技術(shù)探究微生物菌劑處理對生姜土壤中細(xì)菌和真菌群落組成的影響。哈茨木霉屬于木霉屬Trichoderma spp.，木霉屬是植物內(nèi)生生防菌，適應(yīng)性強(qiáng)，繁殖快［１４］。常見的木霉有綠色木霉Trichoderma viride、康寧木霉T.koningii、棘孢木霉T.asperel-lum、深綠木霉T.atrpvorode、哈茨木霉、長枝木霉T.longibrachiatum等。其中哈茨木霉是木霉屬中重要的生防菌資源，其對植物寄生根結(jié)線蟲有較好的防治效果［１５］。馬金慧等［１６］發(fā)現(xiàn)哈茨木霉ＴＲＩ２的４８ｈ發(fā)酵液對根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.防治效果為１００％。淡紫擬青霉是植物寄生線蟲的天敵，廣泛應(yīng)用于防治根結(jié)線蟲、孢囊線蟲Heterodera spp.、馬鈴薯白線蟲Globodera pullida等重要植物病原線蟲［１７１８］。將淡紫擬青霉與雞糞聯(lián)合使用對番茄根結(jié)線蟲的防治效果可達(dá)到７８．３％［１９］?？莶菅堪麠U菌是一類好氧桿狀細(xì)菌，能夠分泌多種酶?？莶菅堪麠U菌在植物根際定殖，可有效防治由尖鐮孢、黃枝孢Clados porium fulvum等病原真菌引起的番茄葉霉病、黃瓜枯萎病等病害［２０］。本試驗(yàn)擬為擴(kuò)大微生物菌劑的使用范圍及田間應(yīng)用價值提供有效的理論基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)設(shè)計

大田試驗(yàn)于２０２１年４月－６月在山東省安丘市臨浯鎮(zhèn)的一塊生姜田中進(jìn)行（３６°１２′Ｎ，１１９°１６′Ｅ）。試驗(yàn)地土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷和有效鉀含量分別為０．９６、２５．６９、１１９．９２ｍｇ／ｋｇ和１９０．８３ｍｇ／ｋｇ，有機(jī)質(zhì)含量１３．２３ｇ／ｋｇ，ｐＨ （土∶水＝１∶２．５）６．８３，電導(dǎo)率２３５．００μｓ／ｃｍ。該地塊有１０年以上的生姜種植歷史。試驗(yàn)選用的生物菌劑（綠地成金）有效活菌數(shù)＞５億ｃｆｕ／ｇ，富含哈茨木霉Trichoderma har-zianum TH7、淡紫擬青霉Pur pureocillium lilaci-num PL22以及高效枯草芽胞桿菌Bacillus subti-lis，由慕恩（廣州）生物科技有限公司提供。根據(jù)微生物菌劑的使用說明，在生姜播種、大培土、小培土、苗期進(jìn)行微生物菌劑兌水（稀釋５０倍）澆灌處理，試驗(yàn)小區(qū)用水量為７００ｍＬ／ｍ（記為ｍｉｃｒｏｂｉａｌａｇｅｎｔ，ＭＡ）。并設(shè)置未經(jīng)微生物菌劑處理小區(qū)為對照組（記為ｃｏｎｔｒｏｌ），每處理設(shè)置３個重復(fù)。試驗(yàn)小區(qū)長為３０ｍ，寬為１．５ｍ，處理組和對照組之間設(shè)有０．５ｍ的緩沖帶。

１．２土樣采集與指標(biāo)測試

生姜成熟期（最后１次菌劑處理后９０ｄ），在田間每個處理小區(qū)中間部位隨機(jī)采集３份５～２０ｃｍ土層土壤樣本２００ｇ置于自封袋內(nèi)，立即送往實(shí)驗(yàn)室。同一小區(qū)的土壤樣品充分混勻后，均分為２份。一份土樣在４℃下保存，用于后續(xù)微生物分離試驗(yàn)。另一份土樣保存于－８０℃冰箱，用于測定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成。

１．２．１土壤中細(xì)菌和真菌分離

采用稀釋涂布法分離土壤中的細(xì)菌和真菌。稱?。常缤劣跍缇模担埃恚屉x心管中并加入２７ｍＬ無菌生理鹽水，得到稀釋１０倍的土壤懸浮液。梯度稀釋土壤懸浮液，分離真菌的土壤懸浮液濃度為１０－２～１０，分離細(xì)菌的土壤懸浮液濃度為１０～１０。

分別吸取１５０μＬ土壤懸浮液加入孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（ＲＢＭ）［２１］、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（ＰＤＡ）、氯硝胺１８％甘油瓊脂培養(yǎng)基（ＤＧ１８）［２２］等真菌分離培養(yǎng)基和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（ＴＳＡ）、Ｒ２Ａ［２３］、ＰＳ［２４］等細(xì)菌分離培養(yǎng)基中，用滅菌玻璃珠搖晃平板將其涂抹均勻，用封口膜密封培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基表面干燥后，將其倒置于２５℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待有菌落產(chǎn)生，按照菌落形態(tài)和顏色特征歸類，并記錄培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量，用于分離頻率的計算。用接種環(huán)挑取單個菌落進(jìn)行分離純化鑒定。細(xì)菌菌株采用１６ＳｒＤＮＡ序列，真菌菌株采用ＩＴＳ序列進(jìn)行分子鑒定。

１．２．２宏基因組學(xué)測序技術(shù)分析土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)組成

?。埃玻担缭冢福啊姹４娴耐寥罉悠酚冢停泄苤校冢停袆驖{儀（ＦａｓｔＰｒｅｐ-２４５Ｇ，ＵＳＡ）中均漿，利用ＦａｓｔＤＮＡ-ＳｐｉｎＫｉｔｆｏｒＳｏｉｌ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）提取土壤基因組總ＤＮＡ，使用０．８％瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀檢測ＤＮＡ 濃度及純度。將ＤＮＡ 樣品送至北京諾禾致源生物技術(shù)有限公司進(jìn)行細(xì)菌１６ＳｒＤ-ＮＡ 的Ｖ５-Ｖ７區(qū)（引物為７９９Ｆ：５′-ＡＡＣＭＧＧＡＴＴ-ＡＧＡＴＡＣＣＣＫＧ-３′ 和１１９３Ｒ：５′ＡＣＧＴＣＡＴＣ-ＣＣＣＡＣＣＴＴＣＣ-３′）和真菌ＩＴＳｒＤＮＡ 的Ｉ區(qū)（引物為ＩＴＳ１Ｆ：５′-ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ-３′和ＩＴＳ１Ｒ：５′-ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ-３′）的ＰＣＲ 擴(kuò)增及文庫構(gòu)建，最后利用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００高通量測序平臺進(jìn)行ＰＥ２５０測序。采用豐富度指數(shù)（Ｃｈａｏｉｎｄｅｘ）［２５］、Ｓｈａｎｎｏｎ 多樣性指數(shù)［２５］和系統(tǒng)發(fā)育多樣性［２６］評價土壤中細(xì)菌群落的多樣性。

１．３數(shù)據(jù)分析

微生物總菌落數(shù)＝培養(yǎng)皿中微生物菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)；

采用ＳＰＳＳ１９．０（ＩＢＭ，ＵＳＡ）軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對微生物菌劑處理組和對照組中土壤細(xì)菌和真菌平均菌落數(shù)、相對豐度等數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）和最小顯著性差異法（ＬＳＤ）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（α＝０．０５）。采用Ｏｒｉｇｉｎ２０１８和Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔｗｏｒｄ２００３分別繪制圖表。

２結(jié)果與分析

２．１稀釋涂布法培養(yǎng)土壤中細(xì)菌和真菌

采用稀釋涂布平板法在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的細(xì)菌和真菌的菌落情況見圖１。由表１可知微生物菌劑處理后的土壤中細(xì)菌和真菌的平均菌落形成單位均顯著低于對照組。與對照相比，微生物菌劑處理土壤中真菌和細(xì)菌的平均菌落形成單位分別減少了３６．１１％和５０．００％。

２．２菌株鑒定

２．２．１細(xì)菌和真菌物種的鑒定

基于細(xì)菌和真菌的分離培養(yǎng)，從對照組土壤中成功鑒定２１株細(xì)菌菌株和３３株真菌菌株，從微生物菌劑處理土壤中成功鑒定４２株細(xì)菌菌株和２４株真菌菌株。物種分布見表２。

在屬水平上，對照組土壤中分離頻率最高的細(xì)菌屬為假單胞菌屬Pseudomonas，菌落形成單位為３×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為９．８３％。其次為壤霉菌屬Agromyces、北里胞菌屬Kitasatospora、污泥單胞菌屬Pelomonas、Piscinibacter，分離頻率均為３．９２％（圖２ａ）。對照組土壤中分離頻率最高的真菌屬為Gibellulopsis，菌落形成單位為２×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為２４．４２％。其次為絲胞菌屬Scedosporium、微結(jié)節(jié)菌屬M(fèi)icrodochium、Musidium、Linneman-nia，分離頻率分別為：１３．３２％、７．６６％、７．２５％、４．６６％（圖３ａ）。微生物菌劑處理土壤中分離頻率最高的細(xì)菌屬為根瘤菌屬Rhizobium，菌落形成單位為４×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１７．３４％。其次為假單胞菌屬、柄桿菌屬Caulobacter、污物假節(jié)桿菌屬Pseudarthrobacter、雷夫松氏菌屬Leifsonia，分離頻率分別為：１０．８４％、８．６７％、５．１３％、４．３４％ （圖２ｂ）。微生物菌劑處理土壤中分離頻率最高的真菌屬為Musidium，菌落形成單位為５×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１３．９１％。其次為Gibellulopsis、小不整球殼屬Plectosphaerella、被孢霉屬M(fèi)ortierella、Lep-tobacillium、Parasarocladium，分離頻率分別為：１２．９７％、１０．３８％、９．５２％、９．４３％、９．４３％（圖３ｂ）。

在種水平上，對照組土壤中分離頻率較高的細(xì)菌種為油菜假單胞菌屬Pseudomonas brassi-cacearum，菌落形成單位為１×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１７．４４％。其次為莫爾氏假單胞菌Pseudomonas umsongensis、Pseudomonas kilonensis、Streptomyces panaciradicis、杰氏假單胞菌Pseudomonas jessenii，分離頻率分別為：５．４９％、３．４９％、３．４９％、３．０５％ （圖４ａ）。對照組土壤中分離頻率較高的真菌種為變黑輪枝菌Gibellulopsis nigrescens，菌落形成單位為２×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１７．８６％。其次為Penicillium me-nonorum、尖端賽多孢子菌Scedosporium apiosper-mum、Scedosporium dehoogii、Linnemannia elongata分離頻率分別為：９．７４％、９．７４％、９．７４％、６．４９％（圖５ａ）。微生物菌劑處理土壤中分離頻率較高的細(xì)菌種是溫哥華假單胞菌Pseudomonas vancouverensis，菌落形成單位為４×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１１．６１％，其次為斯凱爾涅維采根瘤菌Rhizobium skierniewi-cense、米氏假單胞菌Pseudomonas migulae、惰性柄桿菌Caulobacter segnis、莫爾氏假單胞菌P.um-songensis，分離頻率分別為：１０．７２％、５．５８％、５．３６％、３．８３％（圖４ｂ）。微生物菌劑處理土壤中分離頻率較高的真菌種為Musidium stromaticum，菌落形成單位為５×１０ｃｆｕ／ｇ，分離頻率為１２．１４％，其次為變黑輪枝菌Gibellulopsis nigrescens、Plecto-sphaerella oligotrophica、高山被孢霉Mortierella alpina、Leptobacillium symbioticum，分離頻率分別為：１１．３１％、９．４６％、８．３０％、８．２３％（圖５ｂ）。

２．２．２有益物種和有害物種的分離、鑒定

在屬水平上，對照組土壤中分離、純化出５個有益細(xì)菌屬，１４個種，其中包含芽胞桿菌屬Bacillus７個種，間皮芽胞桿菌屬M(fèi)esobacillus １個種，新桿菌屬Neobacillus ２個種，類芽胞桿菌屬Paenibacillus ３個種，嗜冷芽胞桿菌屬Psychrobacillus １個種（表３）。在這些種中，東洋芽胞桿菌Bacillus toyonensis和解木聚糖類芽胞桿菌Paenibacillus xylanilyticus具有較高的分離頻率（均為１．７４％）和菌落形成單位（均為１．４×１０ｃｆｕ／ｇ）。微生物菌劑處理土壤中共分離、純化出７個有益細(xì)菌屬，２１個種，其中包含芽胞桿菌屬Bacillus８個種，銹色房屋芽胞桿菌屬Domibacillus１個種，間皮芽胞桿菌屬M(fèi)esobacillus１個種，新桿菌屬Neobacillus３個種，類芽胞桿菌屬Paenibacillus６個種，嗜冷芽胞桿菌屬Psychrobacillus１個種，水原拉梅爾芽胞桿菌屬Rummeliibacillus１個種（表４）。在這些種中，阿氏芽胞桿菌Bacillus ary-abhattai具有較高的分離頻率和菌落形成單位，分別為２．０１％和７．９×１０ｃｆｕ／ｇ。

對于有害物種，本試驗(yàn)僅從對照處理土壤中分離出導(dǎo)致生姜莖基腐病的病原菌尖鐮孢Fusarium oxysporum和腐皮鐮孢Fusarium solani，純化株數(shù)均為２株，分離頻率分別為０．８１％和０．４９％。

２．３宏基因組測序分析微生物菌劑對土壤中細(xì)菌和真菌結(jié)構(gòu)多樣性的影響

由表５可知，微生物處理后，土壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度指數(shù)（Ｃｈａｏ指數(shù)）、真菌Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)和真菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性均低于對照處理，其中真菌Ｃｈａｏ指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性達(dá)到顯著水平。這表明，微生物菌劑處理降低了土壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性。并且微生物菌劑處理土壤中細(xì)菌的多樣性指數(shù)均高于真菌的多樣性指數(shù)，這表明，微生物菌劑對土壤中真菌多樣性的影響大于對細(xì)菌多樣性的影響。

微生物菌劑和對照處理土壤中細(xì)菌屬數(shù)量（６７８／６４５）大于真菌屬數(shù)量（７２／１０１）。微生物菌劑處理土壤中特有細(xì)菌和真菌屬數(shù)量分別為２０３個和２０個，與對照相比，細(xì)菌特有屬增加了１９．４１％，而真菌特有屬減少了５９．１８％。

對照處理和微生物菌劑處理土壤中細(xì)菌和真菌屬水平相對豐度結(jié)果見圖６。與對照處理相比，微生物菌劑處理顯著增加了根瘤菌屬、柄桿菌屬Caulobucter、污物假節(jié)桿菌屬Pseudarthrobacter、芽胞桿菌屬、雷夫松氏菌屬、紅細(xì)菌屬Rhodanobacter、農(nóng)桿菌屬Agrobacterium等細(xì)菌屬的相對豐度，另外，假單胞菌屬、Bosea、Massilia、中間根瘤菌屬M(fèi)eso-rhizobium等細(xì)菌屬的相對豐度也有所增加，微生物菌劑處理減少了Kitasatospora的相對豐度（圖６ａ）。與對照相比，微生物菌劑處理顯著增加了Musidium、被孢霉屬、Parasarocladium、albifimbria和枝孢屬Cladosporium等真菌屬的相對豐度，減少了Gibellulopsis、微結(jié)節(jié)菌屬M(fèi)icrodochium等屬的相對豐度（圖６ｂ）。

３討論

土壤微生物是土壤重要組成成分，是土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類等的總稱，承擔(dān)著土壤中物質(zhì)運(yùn)輸與能量傳遞的功能，對土壤生態(tài)系統(tǒng)具有重要的意義。有些土壤微生物可參與碳、氮循環(huán)，增加土壤中有機(jī)質(zhì)的含量，并為植物提供可吸收利用的氮化合物；有些土壤微生物可通過寄生或分泌抗生素等物質(zhì)來抑制病原菌的生長［２７］，通常這種微生物可被加工成微生物菌劑在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用。土壤微生物功能的失衡是導(dǎo)致健康土壤成為“病土”的原因之一，病土的特征主要表現(xiàn)在有益微生物數(shù)量下降，有害病原菌大量積累，土壤由“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤罢婢汀保郏玻福玻梗荨Ｎ⑸锞鷦┌罅坑幸嫖⑸?，采用微生物菌劑處理土壤是直接向土壤中補(bǔ)充有益微生物，搶占土壤空間，抑制病原菌的生長，從而達(dá)到控制病害的目的［３０］?？莶菅堪麠U菌可通過與植物根系中的鐵載體結(jié)合搶占在根系的定殖位點(diǎn)，抑制病原菌在根際的定殖［２０］。木霉可通過分泌多種細(xì)胞壁降解酶如幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶等對病原菌產(chǎn)生拮抗作用［３１］。淡紫擬青霉可通過寄生作用防治禾谷孢囊線蟲Heterodera avenae［３２］。

本試驗(yàn)采用微生物菌劑對大田生姜進(jìn)行澆灌處理，采集最后一次微生物菌劑處理后９０ｄ的土壤樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，微生物菌劑對土壤中的細(xì)菌和真菌數(shù)量具有一定的抑制作用。Ｓｈｅｎ等［１１］在氨熏蒸的土壤中澆灌生物菌肥發(fā)現(xiàn)土壤中的細(xì)菌和真菌的多樣性在９０ｄ后仍低于未澆灌生物菌肥處理，本研究的結(jié)果與此一致。在屬、種水平上，與對照相比，微生物菌劑處理土壤中分離、純化的細(xì)菌物種數(shù)量較高，而真菌物種數(shù)量較低。微生物菌劑處理土壤分離頻率較高的屬是根瘤菌屬Rhizobium，根瘤菌具有很強(qiáng)的固氮作用，可在生姜生長過程中提高生姜對氮素的吸收和利用。微生物菌劑處理土壤中假單胞菌屬的分離頻率為１０．８４％。路兆軍等［３３］研究表明，分離自蘋果樹根際的假單胞菌ＰＬ-２１對蘋果褐斑病菌Murssonina coronarias、蘋果圓斑病菌Phyllositic solitaria有較好的防治作用。婁海博等［３４］發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌PseudomonasＳＮ１５-２對番茄青枯病的防效效果為４６．６％。

有益微生物的分離結(jié)果顯示，微生物菌劑能夠提高土壤中有益微生物的數(shù)量。對照土壤中分離、純化出１４種有益微生物，而微生物菌劑處理土壤中分離、純化出２１種有益微生物。其中分離、純化較多的屬為芽胞桿菌屬。目前，芽胞桿菌屬已開發(fā)成為成熟的微生物制劑。Ｈｕａｎｇ等［３５］研究表明芽胞桿菌屬可抑制草莓枯萎病的發(fā)生。

宏基因組測序結(jié)果表明，微生物菌劑處理降低了土壤中細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度指數(shù)Ｃｈａｏ指數(shù)、真菌Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)，說明此微生物菌劑對土壤中細(xì)菌和真菌具有抑制作用，這與稀釋涂布平板法得到的結(jié)果相一致。物種屬水平相對豐度結(jié)果顯示，微生物菌劑增加了根瘤菌屬、芽胞桿菌屬等細(xì)菌屬的相對豐度，以及小不整球殼屬、Musidium、被孢霉屬等真菌屬的相對豐度。根瘤菌屬、芽胞桿菌屬中的某些種已被證明是有益的土壤細(xì)菌微生物。小不整球殼屬是植物內(nèi)生真菌，具有分解纖維素的能力［３６３７］。Musidium屬于子囊菌門，子囊菌在植物根部形成菌根，提高植物吸收養(yǎng)分的能力，促進(jìn)植物生長［３８］。被孢霉屬屬于接合菌門，某些特定的被孢霉屬菌株具有促進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的作用，例如被孢霉Mortierella sp.具有在不同土壤中分泌有機(jī)酸溶解土壤磷的能力［３９］，另外被孢霉與從枝菌根真菌聯(lián)合使用能提高土壤中磷酸酶活性，有利于植物生長［４０］。將被孢霉添加到果園土壤中，土壤中有效磷、速效鉀以及鈣、鎂、硼等的含量顯著增加［４１］。

另外，在本試驗(yàn)中，我們注意到微生物菌劑處理后９０ｄ的土壤樣本中分離頻率較高的屬為芽胞桿菌屬。多項(xiàng)土壤微生物多樣性研究結(jié)果表明，芽胞桿菌屬在土壤中具有較高的相對豐度［４２４３］。微生物菌劑施入土壤中后，由于純化的有益微生物的數(shù)量龐大，可快速搶占土壤空間，在一定程度上抑制其他微生物（包括病原菌）的生長。隨著使用時間的延長，土壤中的非致病土著微生物（包括有益菌）的數(shù)量會得到恢復(fù)，但病原菌在有益微生物搶占定殖位點(diǎn)、寄生、重拮抗等的作用機(jī)制下以及非致病微生物搶占土壤空間的作用下，數(shù)量難以快速恢復(fù)，從而達(dá)到控制病害的目的。但微生物菌劑貨架期短、土壤環(huán)境條件不同等因素可能導(dǎo)致微生物菌劑不能很好地適應(yīng)土壤環(huán)境，難以快速繁殖，在生態(tài)位的競爭中難與土著微生物抗衡［４４］，這可能是導(dǎo)致微生物菌劑在使用后期不再是優(yōu)勢物種的原因之一。

雖然微生物菌劑具有較好的應(yīng)用效果，但微生物菌劑在使用中仍然面臨諸多挑戰(zhàn)：１）微生物菌劑的活性低及貨架期短：與化學(xué)農(nóng)藥相比，微生物菌劑在加工成各種劑型及長時間保存的過程中其活性會受到影響，導(dǎo)致微生物菌劑的持效期變短。Ｗｕ等［４３］比較了土壤中分離、純化的哈茨木霉菌株Ｔ２６７與哈茨木霉制劑在土壤中的活性，并對處理后６周的土壤中的哈茨木霉菌株進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明Ｔ２６７在土壤中的基因拷貝數(shù)顯著高于制劑的基因拷貝數(shù)。２）施藥次數(shù)多：田間土壤環(huán)境復(fù)雜，微生物菌劑并不能完全適應(yīng)土壤環(huán)境并快速、長期定殖，在作物生長過程中，至少需要４～５次的灌根處理。因此未來微生物菌劑應(yīng)加大對高效、實(shí)用、適應(yīng)性強(qiáng)的功能菌株的開發(fā)、利用，減少施藥次數(shù)，提高微生物菌劑的認(rèn)可度。另一方面，對現(xiàn)有的微生物菌劑有必要結(jié)合基因工程改造技術(shù)，培育出能適應(yīng)多種大田環(huán)境的高效菌株。

４結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照相比，微生物菌劑處理雖然降低了土壤中細(xì)菌和真菌物種的菌落數(shù)以及細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)豐富度指數(shù)（Ｃｈａｏ指數(shù)）、真菌Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)，但提高了土壤中根瘤菌屬、假單胞菌屬、芽胞桿菌屬等細(xì)菌屬及小不整球殼屬、Musidium、被孢霉屬等真菌屬的相對豐度，并且與對照相比這些屬的分離頻率較高。綜上，微生物菌劑（綠地成金）處理土壤后能夠改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增加與有益菌相關(guān)的屬或種的相對豐度。