左慧琳，李小翠，區(qū)曉君，楊彩華，劉中秋，4，梁奇，朱麗君，4（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，國際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 10006；2. 中華人民共和國教育部中醫(yī)藥防治腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究聯(lián)合實驗室，廣東 廣州 10006；. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 101；4. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)粵港澳中醫(yī)藥與免疫疾病研究聯(lián)合實驗室，廣東 廣州 10006；. 深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 181）

苯甲酰新烏頭原堿（Benzoylmesaconine，BMA）是中藥附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata）的6 種質(zhì)量控制標(biāo)志物之一，具有顯著的鎮(zhèn)痛和抗炎活性[1-4]。BMA 能顯著抑制醋酸誘導(dǎo)的疼痛模型小鼠的扭體反應(yīng)，增加反復(fù)冷應(yīng)激大鼠的足壓痛閾值，降低膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹的程度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)[5-7]。但是，BMA 也具有一定的神經(jīng)和心臟毒性，安全窗窄，口服和靜脈給藥BMA 在小鼠上的半數(shù)致死量（LD50）分別為810 和21 mg·kg-1[1-2，8]。對26 批附子的含量測定發(fā)現(xiàn)，BMA 是附子6 種質(zhì)量控制標(biāo)志物中含量最高的成分，最高可達(dá)389 μg·g-1，平均含量為144 μg·g-1[8]。可見，BMA 對附子的整體藥效和毒性有著重要貢獻(xiàn)[9]，因此，闡明BMA 藥效和毒性的控制作用機(jī)制對保障附子的有效應(yīng)用與安全性具有重要意義。

多藥耐藥蛋白（Multidrug resistance protein 1，MDR1）是三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，在體內(nèi)組織器官中廣泛分布，是影響藥物體內(nèi)處置及毒效的關(guān)鍵因素之一[10-17]。課題組前期采用Caco-2細(xì)胞模型研究表明，BMA 的外排受MDR1 調(diào)控。在MDR1 抑制劑的作用下，BMA 在Caco-2 細(xì)胞上的表觀滲透系數(shù)增加約7.41 倍，外排率下降約75%[18]。然而，MDR1 是否參與調(diào)控BMA 的藥效、毒性以及體內(nèi)暴露尚不清楚。因此，本研究采用外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因敲除的Mdr1a-/-小鼠（小鼠abcb1a基因編碼的蛋白Mdr1a 與人類ABCB1 基因編碼的蛋白MDR1 同源）和野生型FVB 小鼠模型來考察Mdr1a 對BMA 藥效、毒性及體內(nèi)暴露的影響，為BMA 的后續(xù)藥理和藥動學(xué)研究以及附子的安全有效應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料1290 超高效液相色譜儀、6460 三重四極桿質(zhì)譜儀，美國Aglient 公司；5810R 冷凍高速離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；BSA224S-CW 電子分析天平，德國Sartorius 公司；SPD1010-230 真空離心濃縮儀，美國Thermo Fisher Scientific 公司；ElixEssential15（UV）超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司；Tissuelyser-24 全自動樣品快速研磨儀，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司。苯甲酰新烏頭原堿，成都曼思特生物科技有限公司，純度≥98%，批號：MUST-15 012216；利血平（內(nèi)標(biāo)），上海阿拉丁公司，純度≥98%，批號：WXBC9972V；雙氯芬酸鈉，上海源葉公司，批號：Y29S11C 126393；醋酸，上海阿拉丁公司，批號：J1 811172；角叉菜膠，美國Sigma-Aldrich 公司，批號：SLBW1046；異氟烷，深圳瑞沃德生命科學(xué)有限公司，批號：21 103001；S100B 鈣結(jié)合蛋白B（S100B）和肌酸激酶（CK）ELISA 試劑盒，武漢華美生物工程有限公司，批號分別為：M25016967和M23 016966；Hank’s 平衡鹽溶液（HBSS），美國Sigma-Aldrich 公司，批號為SLBL7680V；其他化學(xué)藥品和試劑均為分析純及以上級別。

1.2 動物Mdr1a-/-小鼠，均為99%以上FVB 小鼠遺傳背景，購自上海南方模式生物研究中心。野生型FVB 小鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。所有小鼠均為SPF 級別，6～8 周齡，雄性，體質(zhì)量約21～25 g，實驗前在SPF 級飼養(yǎng)室[溫度（25 ±2）℃，相對濕度（50 ± 5）%，12 h 暗/光循環(huán)]適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。實驗前小鼠均禁食不禁水10～12 h。本研究所進(jìn)行的所有動物實驗均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)， 動物實驗倫理審查表編號：IITCM20180907。

1.3 BMA 對Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的鎮(zhèn)痛作用采用醋酸致小鼠疼痛扭體模型考察鎮(zhèn)痛作用。Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為3 組，每組6 只。各組小鼠均按10 mL·kg-1體積灌胃給藥，空白組給予生理鹽水，陽性藥組給予雙氯芬酸鈉50 mg·kg-1，BMA 組小鼠給予BMA 20 mg·kg-1。灌胃30 min 后，腹腔注射1%醋酸（約0.22 mL）。腹腔注射醋酸5 min 后，記錄15 min 內(nèi)小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)（腹部凹陷、軀干和后肢伸展和臀部翹起均視為扭體反應(yīng)）[19]。

1.4 BMA 對Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的抗炎作用采用角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠急性炎癥模型考察抗炎作用[19]。Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠按“1.3”項下分組與灌胃。灌胃30 min 后，測量小鼠右后足跖厚度（即造模前爪足厚度）。然后將小鼠放入裝有2.5%異氟烷的配套小室中，保持1 min 以使小鼠完全麻醉。之后，將小鼠從小室取出，將小鼠的頭部和鼻子放入裝有1.0%異氟烷和500 mL·min-1氧氣的麻醉面罩中，維持麻醉。在小鼠右后足跖下組織皮下注射20 μL 2%角叉菜膠。角叉菜膠處理4 h 后，再次測量右后足跖厚度（即造模后爪足厚度）。按照以下公式計算小鼠足腫脹率：足腫脹率（%）=（造模后爪足厚度-造模前爪足厚度）/造模前爪足厚度×100%。

1.5 UHPLC-MS/MS 分析方法

1.5.1 色譜條件 超高液相色譜系統(tǒng)為Agilent 1290 infinity LC system； 色譜柱為 Waters ACQUITY UHPLC HSS?T3 1.8 μm（2.1 mm×100 mm）；流動相A 為0.1%甲酸-水溶液（甲酸∶超純水=1∶999，V/V），流動相B 為乙腈；柱溫為35 ℃；流速為0.4 mL·min-1，后運(yùn)行1.00 min；進(jìn)樣室溫度為6 ℃；進(jìn)樣體積為5 μL；洗脫程序為：0～1 min，30% B；1～2.5 min，30%～90% B；2.5～3.5 min，90% B；3.5～4.5 min，90%～30% B。

1.5.2 質(zhì)譜條件 使用Agilent 6460 三重四級桿質(zhì)譜，離子源為AJS ESI，采用正離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式采集數(shù)據(jù)；毛細(xì)管電壓為4.0 kV；干燥氣溫度為300 ℃；霧化器壓力45 psi（1 psi≈6.895 kPa）；噴嘴電壓為500 V；鞘氣溫度為350 ℃；氮?dú)怏w積流量為5 L·min-1；鞘氣體積流量為11 L·min-1；定量分析的離子對：BMA（m/z590→540），利血平（m/z609→195）；碎裂電壓：BMA 135 V，利血平210 V；碰撞能：BMA 34 V，利血平38 V。

1.5.3 方法學(xué)考察[20]對小鼠血漿和肝臟組織中BMA的定量分析方法進(jìn)行專屬性、線性范圍、精密度和準(zhǔn)確度、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性考察。

1.6 BMA 對Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的神經(jīng)和心臟毒性研究

1.6.1 腦和心臟的組織病理學(xué)觀察 將Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠隨機(jī)分為2 組，每組4 只?？瞻讓φ战M灌胃生理鹽水10 mL·kg-1，實驗組灌胃BMA 20 mg·kg-1。給藥8 h 后，處死小鼠，迅速取出腦和心臟，置于4%多聚甲醛中固定48 h 后，石蠟包埋，在冠狀面切取厚度為6 μm 切片[19]。蘇木精伊紅染色，在顯微鏡下觀察。

1.6.2 腦S100B 和心臟CK 水平的檢測 動物分組和給藥方法同“1.6.1”項。小鼠處死后迅速取出腦和心臟，分成兩部分，一部分用于生化指標(biāo)分析，另一部分用于BMA 的含量測定。用于生化指標(biāo)分析的組織置于10 倍組織質(zhì)量的冷凍1 × PBS 中，然后用組織勻漿器在65 Hz 下勻漿2 min，5 000g，4 ℃離心5 min，取上清液并立即進(jìn)行檢測。嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測腦中S100B 和心臟中CK 水平。

1.6.3 BMA 在小鼠腦和心臟組織中的含量測定 將用于含量測定的組織樣品放入新的1.5 mL 離心管中，加入2 倍組織質(zhì)量的冷凍生理鹽水（pH=7.4）進(jìn)行勻漿，勻漿條件同“1.6.2”項。每個樣品勻漿5 次。之后，將組織勻漿保存于-20 ℃，備用。

1.7 BMA 在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠體內(nèi)的組織分布研究將Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠隨機(jī)分為2 組，每組4 只。靜脈注射BMA 1 mg·kg-1，分別在0.5 和2 h 時間點從小鼠眼眶后靜脈叢取血約20 μL，之后頸椎脫臼處死，迅速取出膽囊、腦、心、肝、腎、小腸和結(jié)腸并稱質(zhì)量。將組織樣品放入新的1.5 mL 離心管中，加入2 倍組織質(zhì)量的冷凍生理鹽水（pH=7.4）進(jìn)行勻漿，勻漿條件同“1.6.2”項。每個樣品勻漿5 次。然后，將組織勻漿液保存于-20 ℃，待處理。將血液樣本在956g下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并保存于-20 ℃，備用。

1.8 BMA 在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究將Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠隨機(jī)分為2 組，其中Mdr1a-/-小鼠每組4 只，F(xiàn)VB 小鼠每組6 只。Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠灌胃BMA 20 mg·kg-1或尾靜脈注射BMA 1 mg·kg-1后，分別在0、5、10、20、30、60、120、240、360、480、720 min 等不同時間點，從尾靜脈采集血樣約20 μL。然后，將血液樣本在956g下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并保存于-20 ℃，備用。

1.9 BMA 在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠腸道吸收研究將Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠隨機(jī)分為2 組，每組4 只。各組小鼠均按3 mL·kg-1體積腹腔注射50%烏拉坦麻醉劑，待小鼠麻醉后，將其固定在恒溫床上，保持體溫正常穩(wěn)定。然后用酒精消毒小鼠表面皮膚，并剃除腹部毛發(fā)，沿小鼠腹中線打開腹腔約2 cm 至膈膜下端，暴露腸組織。在十二指腸和結(jié)腸的兩端插入聚乙烯管，用手術(shù)線固定好。插好管后用37 ℃的生理鹽水緩慢沖洗腸道內(nèi)容物。然后用生理鹽水浸潤紗布，覆蓋小鼠腸組織表面，保持腸道的濕潤。用空白HBSS 緩沖液以10 mL·h-1的流速沖洗十二指腸和結(jié)腸15 min，以清洗其內(nèi)容物。更換含10 μmol·L-1BMA 的HBSS 緩沖液，預(yù)灌流30 min，以達(dá)到穩(wěn)態(tài)吸收。然后，在60 min 內(nèi)每隔15 min 從十二指腸和結(jié)腸下端的出口管收集灌流液。灌流結(jié)束后，剪開整個十二指腸和結(jié)腸，測量并記錄其長度。按文獻(xiàn)方法[21]對有效表觀滲透系數(shù)（Peff）和排泄到灌流液中的BMA 含量進(jìn)行檢測和計算。

1.10 樣品制備取血漿（10 μL）或組織勻漿樣品（20 μL）與50%（V/V）乙腈水溶液（10 μL）混合均勻。然后，在血漿或組織勻漿樣品中分別加入180 μL 或170 μL 乙腈（含有50 nmol·L-1利血平）。渦旋4 min后，20 800g離心10 min。然后，將上清液（160 μL）轉(zhuǎn)移到新的離心管中，常溫下真空干燥2 h 后，加入50%乙腈水溶液80 μL 復(fù)溶，20 800g，4 ℃，離心30 min。取上清液5 μL，采用Agilent UHPLC-MS/MS 分析樣品。膽汁樣本的處理與血漿樣本相同。灌流液樣本的處理：取灌流液10 μL，加入50%乙腈水溶液90 μL（含100 nmol·L-1利血平），渦旋3 min后，在4 ℃，20 800g條件下離心30 min，取上清進(jìn)樣，采用Agilent UHPLC-MS/MS 分析樣品。

1.11 數(shù)據(jù)分析采用Win Nonlin 3.3 軟件（美國Pharsight 公司）進(jìn)行藥動學(xué)分析。采用GraphPad prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。使用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Student’st檢驗（兩組）或One-way ANOVA 以及LSD 檢驗（兩組或多組）評估顯著性差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMA 對Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的鎮(zhèn)痛作用結(jié)果見圖1。在醋酸誘導(dǎo)的疼痛模型中，扭體次數(shù)越少表明鎮(zhèn)痛效果越強(qiáng)。與空白對照組相比，F(xiàn)VB 小鼠和Mdr1a-/-小鼠口服BMA 后，扭體次數(shù)分別減少了55.09%和81.90%（P＜0.05）?？诜?0 mg·kg-1BMA 后，與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠的扭體次數(shù)下降60.82%（P＜0.05）。

圖1 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）對Mdr1a-/-和野生型FVB小鼠的鎮(zhèn)痛作用（±s，n=6）Figure 1 The analgesic effects of benzoylmesaconine（BMA）on Mdr1a-/- and wild-type FVB mice（±s，n=6）

2.2 BMA 對Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的抗炎作用結(jié)果見圖2。在角叉菜膠誘導(dǎo)的急性炎癥模型中，足腫脹率越低，抗炎作用越強(qiáng)。與空白對照組相比，F(xiàn)VB 小鼠和Mdr1a-/-小鼠口服BMA 后，足腫脹率分別減少了50.58%和74.34%（P＜0.05）。與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠的足腫脹率有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）對Mdr1a-/-和野生型FVB小鼠的抗炎作用（±s，n=6）Figure 2 The anti-inflammatory effects of BMA on Mdr1a-/-and wild-type FVB mice（±s，n=6）

2.3 方法學(xué)考察小鼠血漿和肝勻漿中BMA 的代表性色譜圖見圖3。在BMA（1.6 min）和利血平（2.6 min）的保留時間處沒有干擾組分引起的顯著響應(yīng)，分離效果較好，峰形理想。小鼠血漿和肝臟組織中BMA的線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)，以及穩(wěn)定性考察結(jié)果見表1 ～表4。結(jié)果均顯示該方法符合樣品測定要求。

表1 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）在小鼠血漿和肝臟樣品中的線性范圍、回歸方程、定量下限和相關(guān)系數(shù)Table 1 The linear range，regression equations，quantitative limit and correlation coefficients of BMA in plasma and liver of mice

表2 小鼠血漿和肝臟樣品中苯甲酰新烏頭原堿（BMA）日內(nèi)和日間的精密度和準(zhǔn)確度（±s，n=6）Table 2 Intra-day and inter-day precision and accuracy of BMA in plasma and liver of mice（±s，n=6）

表2 小鼠血漿和肝臟樣品中苯甲酰新烏頭原堿（BMA）日內(nèi)和日間的精密度和準(zhǔn)確度（±s，n=6）Table 2 Intra-day and inter-day precision and accuracy of BMA in plasma and liver of mice（±s，n=6）

日內(nèi)/%濃度/（nmol·L-1）日間/%樣品血漿肝臟9.77 312.50 5 000.00 19.54 312.50 5 000.00精密度（RSD）8.01 4.09 4.87 4.72 3.09 5.72準(zhǔn)確度91.19±7.20 95.12±3.46 109.44±1.91 105.39±3.98 90.44±2.86 93.43±6.03精密度（RSD）6.88 4.60 2.59 4.41 4.61 7.84準(zhǔn)確度99.75±8.23 100.56±4.04 107.20±3.59 104.12±5.74 90.70±3.86 94.02±6.15

表3 小鼠血漿和肝臟樣品中苯甲酰新烏頭原堿（BMA）的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（±s，n=6）Table 3 The extraction recoveries and matrix effects of BMA in plasma and liver of mice（±s，n=6）

表3 小鼠血漿和肝臟樣品中苯甲酰新烏頭原堿（BMA）的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（±s，n=6）Table 3 The extraction recoveries and matrix effects of BMA in plasma and liver of mice（±s，n=6）

樣品血漿肝臟濃度/（nmol·L-1）9.77 312.50 5 000.00 19.54 312.50 5 000.00提取回收率/%89.56±5.80 93.83±2.77 92.40±1.69 95.59±7.70 87.79±3.60 99.41±2.88基質(zhì)效應(yīng)/%95.17±2.83 89.16±2.67 90.00±1.32 84.68±6.75 87.76±5.71 93.64±2.13

表4 小鼠血漿和肝臟樣品中苯甲酰新烏頭原堿（BMA）的穩(wěn)定性（±s，n=6）Table 4 The stability of BMA in plasma and liver of mice（±s，n=6）

表4 小鼠血漿和肝臟樣品中苯甲酰新烏頭原堿（BMA）的穩(wěn)定性（±s，n=6）Table 4 The stability of BMA in plasma and liver of mice（±s，n=6）

樣品血漿肝臟濃度/（nmol·L-1）9.77 312.50 5 000.00 19.54 312.50 5 000.00室溫放置6 h實測值/（nmol·L-1）10.22±0.82 318.06±12.58 5 473.29±120.44 20.33±0.56 283.29±11.65 4 784.57±306.07準(zhǔn)確度/%104.65±8.39 101.78±4.03 109.47±2.41 104.12±2.88 90.65±3.73 95.69±6.12-20 ℃放置1 周實測值/（nmol·L-1）9.65±0.66 312.91±13.93 5 337.38±192.82 21.70±0.88 283.74±11.99 4 715.26±287.73準(zhǔn)確度/%98.73±6.70 100.13±4.46 106.75±3.86 110.40±4.53 90.80±3.84 94.31±5.75-20 ℃至室溫反復(fù)凍融3 次實測值/（nmol·L-1）9.29±0.77 311.75±12.78 5 269.28±178.32 21.77±1.28 282.25±14.63 4 603.89±353.58準(zhǔn)確度/%95.08±7.87 99.76±4.09 105.39±3.57 111.98±6.57 90.64±4.68 92.08±7.07

圖3 小鼠血漿和肝臟中苯甲酰新烏頭原堿（BMA）的代表性色譜圖Figure 3 Representative chromatograms of BMA in plasma and liver of mice

2.4 BMA 對Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的神經(jīng)毒性研究口服20 mg·kg-1BMA 后，Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的腦組織切片、S100B 水平和BMA 含量測定結(jié)果見圖4?？诜﨎MA 8 h 后，Mdr1a-/-小鼠海馬DG 區(qū)和CA 區(qū)細(xì)胞間隙增大（見圖4-B2、-D2 圖中黑色邊框處）。與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠口服BMA 后，海馬區(qū)細(xì)胞數(shù)量減少，錐體細(xì)胞核固縮嚴(yán)重（圖4-B2、-D2 圖中黑色邊框處）。與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠腦中的S100B 水平和BMA 的含量分別增加了0.60 和3.12 倍（P＜0.05）。

圖4 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）的神經(jīng)毒性及Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠腦內(nèi)BMA 水平（±s，n=4）Figure 4 The neurotoxicity of BMA and BMA levels in the brain of Mdr1a-/- and wild-type FVB mice（±s，n=4）

2.5 BMA 對Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的心臟毒性研究口服20 mg·kg-1BMA 后，Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的心臟組織切片、CK 水平和BMA 含量測定結(jié)果見圖5。口服BMA 8 h 后，與野生型FVB 小鼠相比，BMA 在Mdr1a-/-小鼠心臟中的分布增加了2.64 倍（P＜0.05）。但各組小鼠心肌組織未見明顯病理改變，心臟CK 水平也無明顯變化。

圖5 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）的心臟毒性及Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠心臟中BMA 水平（±s，n=4）Figure 5 The cardiotoxicity of BMA and BMA levels in the heart of Mdr1a-/- and wild-type FVB mice（±s，n=4）

2.6 BMA 在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠組織中的分布特征結(jié)果見圖6。與野生型FVB 小鼠相比，靜脈注射1 mg·kg-1BMA 0.5 h 后，Mdr1a-/-小鼠腦、心臟、腎臟、結(jié)腸和血漿中BMA 的含量分別增加了1.06、1.34、0.59、2.36 和0.88 倍。給藥2 h 后，與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠腦、心臟、腎臟、小腸、結(jié)腸和血漿中的BMA 水平分別增加了1.58、0.67、1.27、2.08、1.22 和0.44 倍；膽汁中BMA的蓄積量減少約86.26%（P＜0.05）。

圖6 靜脈注射1 mg·kg-1 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）0.5 和2 h 后，BMA 在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠組織中的分布及在血漿和膽汁中的濃度（±s，n=4）Figure 6 Tissue distribution of BMA，the concentrations of BMA in the plasma and bile of Mdr1a-/- and wild-type FVB mice after intravenous injection of 1 mg·kg-1 BMA for 0.5 and 2 hours（±s，n=4）

2.7 BMA 在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征BMA 在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征和參數(shù)見圖7 和表5。與FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠體內(nèi)BMA 的生物利用度（F）增加了4.53 倍（P＜0.05）。同時，口服20 mg·kg-1BMA后，Mdr1a-/-小鼠體內(nèi)BMA 的藥時曲線下面積（AUC0-t）和AUC0-∞分別增加了1.46 倍和2.63 倍，清除率（Cl）和表觀分布容積（Vd）分別降低了66.13%和78.85%（P＜0.05）。靜脈注射1 mg·kg-1BMA 后，與野生型FVB 小鼠相比，BMA 在Mdr1a-/-小鼠上的平均滯留時間（MRT0-∞）顯著增加了1.79 倍（P＜0.05）。

表5 Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠口服20 mg·kg-1 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）或靜脈注射1 mg·kg-1 BMA 后的藥動學(xué)參數(shù)（±s，n=4～6）Table 5 The pharmacokinetic parameters of BMA after oral administration of 20 mg·kg-1 or intravenous injection of 1 mg·kg-1 BMA in Mdr1a-/- and wild-type FVB mice（±s，n=4～6）

表5 Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠口服20 mg·kg-1 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）或靜脈注射1 mg·kg-1 BMA 后的藥動學(xué)參數(shù)（±s，n=4～6）Table 5 The pharmacokinetic parameters of BMA after oral administration of 20 mg·kg-1 or intravenous injection of 1 mg·kg-1 BMA in Mdr1a-/- and wild-type FVB mice（±s，n=4～6）

注：與野生型FVB 小鼠相比，*P＜0.05

給藥方式口服劑量/（mg·kg-1）20 Mdr1a-/-小鼠1.33±0.55*738.26±186.87 238.76±70.00*353.41±159.95*7.44±4.97 10.34±5.97 60.15±23.87*0.11±0.05*26.91±12.18*63.11±5.19 65.66±6.02 3.86±1.41 1.96±0.54*8.59±2.92 0.026±0.002 6參數(shù)靜注1 tmax/h Cmax/（nmol·L-1）AUC0-t/（min·μmol-1·L-1）AUC0-∞（min·μmol-1·L-1）t1/2/h MRT0-∞/h Vd/（L·kg-1）Cl/（L·min-1·kg-1）F/%AUC0-t/（min·μmol-1·L-1）AUC0-∞/（min·μmol-1·L-1）t1/2/h MRT0-∞/h Vd/（L·kg-1）Cl/（L·min-1·kg-1）野生型FVB小鼠0.43±0.37 594.00±121.07 65.74±20.61 71.22±22.46 3.96±0.90 3.91±0.56 177.57±67.61 0.52±0.18 4.87±1.53 72.67±11.88 73.18±11.91 2.41±1.60 0.70±0.27 4.87±3.37 0.024±0.004 1

圖7 小鼠單次灌胃20 mg·kg-1 苯甲酰新烏頭原堿（BMA）（A）或靜脈注射1 mg·kg-1 BMA（B）后的平均血藥濃度-時間曲線（±s，n=4～6）Figure 7 The mean plasma concentration-time curves of BMA after oral administration of 20 mg·kg-1 BMA（A）or intravenous injection of 1 mg·kg-1 BMA（B）in Mdr1a-/- and wild-type FVB（±s，n=4～6）

2.8 BMA 在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠腸道的吸收特征結(jié)果見圖8。BMA 在小鼠十二指腸中的吸收特征數(shù)據(jù)顯示，其有效表觀滲透系數(shù)（Peff）從野生型FVB 小鼠的0.25 顯著增加至Mdr1a-/-小鼠的1.25，即增加了4 倍（P＜0.05）。與野生型FVB 小鼠相比，BMA 在Mdr1a-/-小鼠十二指腸的吸收率和吸收量均顯著增加了3.96 倍（P＜0.05）。Mdr1a 的缺失對BMA在小鼠結(jié)腸的Peff值、吸收百分率和吸收量無影響。

圖8 苯甲酰新烏頭源堿（BMA）在Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠腸道的吸收特征（±s，n=4）Figure 8 The intestinal absorption characteristics of BMA on Mdr1a-/- and wild-type FVB mice（±s，n=4）

3 討論

苯甲酰新烏頭原堿（BMA）是附子質(zhì)量控制標(biāo)志物之一，不僅具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎活性，還有一定的神經(jīng)和心臟毒性[1-4]。前期研究[18]表明BMA 在體外被MDR1 外排，但MDR1 是否參與調(diào)控BMA 的鎮(zhèn)痛抗炎活性、神經(jīng)心臟毒性以及體內(nèi)處置尚不清楚。人類ABCB1 基因編碼的蛋白MDR1 與小鼠abcb1a 基因編碼的蛋白Mdr1a 同源。本研究開展了BMA 對Mdr1a-/-和野生型FVB 小鼠的鎮(zhèn)痛抗炎活性、神經(jīng)心臟毒性以及藥動學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)Mdr1a 可通過顯著改變BMA 在小鼠組織的分布、血漿暴露量和腸道吸收來調(diào)控其鎮(zhèn)痛作用和神經(jīng)毒性，但Mdr1a 對BMA 的抗炎作用和心臟毒性無明顯調(diào)控作用。

本研究首先采用醋酸扭體模型和角叉菜膠誘導(dǎo)急性炎癥模型來分別考察Mdr1a 對BMA 鎮(zhèn)痛和抗炎活性的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMA 的鎮(zhèn)痛和抗炎作用較強(qiáng)，其作用強(qiáng)度與陽性藥雙氯芬酸鈉相當(dāng)。鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果表明，BMA 在野生型FVB 小鼠上的疼痛抑制率約為55%（P＜0.05）。據(jù)研究[5]報道，小鼠口服20 mg·kg-1BMA 后的疼痛抑制率約為52%，這與本研究結(jié)果基本一致。與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠腹腔注射醋酸后，BMA 的鎮(zhèn)痛作用明顯增強(qiáng)，疼痛抑制率達(dá)到82%（P＜0.05），Mdr1a 的缺失使BMA 的鎮(zhèn)痛效果得以明顯增強(qiáng)。然而，與野生型FVB 小鼠相比，BMA 對Mdr1a-/-小鼠的抗炎活性雖有增強(qiáng)趨勢，但無顯著性差異，這可能與角叉菜膠和醋酸的造模時間不同有關(guān)。本研究中醋酸作用5 min 即開始考察鎮(zhèn)痛活性，而角叉菜膠需作用4 h才開始考察抗炎活性。由藥動學(xué)結(jié)果可知Mdr1a-/-小鼠灌胃BMA 后，tmax為1.33 h，即4 h 前的時間點為BMA 的峰濃度（考察鎮(zhèn)痛活性的時間在0.58～0.83 h之間），4 h 時間點后的血藥濃度相對較低（考察抗炎活性的時間在4.5～4.6 h 之間）。這可能是Mdr1a 缺失會影響B(tài)MA 的鎮(zhèn)痛作用但對抗炎作用無顯著影響的原因之一。此外，這也可能與小鼠足跖下組織Mdr1a 的分布情況有關(guān)，Mdr1a 缺失是否會影響B(tài)MA在足跖下組織的分布尚不清楚。因此，后續(xù)研究可通過采用多種炎癥模型，比如二甲苯誘導(dǎo)耳廓腫脹模型和棉球肉芽腫模型[22]，以綜合考察Mdr1a 對BMA 抗炎作用的調(diào)控機(jī)制。

本研究進(jìn)一步采用組織病理切片和ELISA 法考察了Mdr1a 對BMA 神經(jīng)和心臟毒性的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，口服BMA 8 h 后，與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠的腦部海馬DG 區(qū)和CA 區(qū)的細(xì)胞排列更加稀疏，細(xì)胞數(shù)量急劇下降。并且，Mdr1a-/-小鼠海馬區(qū)出現(xiàn)明顯的錐體細(xì)胞核固縮。S100B 是一種高度保守的鈣結(jié)合蛋白，廣泛分布于機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在大腦發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷時，由大腦中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌，進(jìn)入大腦內(nèi)細(xì)胞外液，是判斷大腦毒性程度的具體直觀指標(biāo)之一[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠腦中的S100B水平顯著增加（P＜0.05）。同時，Mdr1a-/-小鼠腦中BMA 的濃度增加了3 倍。這證明了Mdr1a 可能通過調(diào)控BMA 在小鼠腦中暴露水平以增加其神經(jīng)毒性。

野生型FVB 小鼠和Mdr1a-/-小鼠灌胃BMA 后，心肌纖維排列規(guī)則，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，CK 水平也無明顯變化。這表明Mdr1a 缺失對BMA 的心臟毒性無明顯影響。這可能與心臟組織中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分布和功能有關(guān)。研究表明心臟組織表達(dá)的ABC 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅參與藥物以及心臟毒性物質(zhì)的外排，還與心臟自身的離子通道傳導(dǎo)特性和溶酶體功能密切相關(guān)[24]。同時，本研究僅考察了小鼠灌胃BMA 后心臟組織病理切片和CK 水平的變化，尚未對小鼠的心臟功能進(jìn)行深入考察。因此，Mdr1a 缺失是否會影響B(tài)MA 的心臟毒性及其機(jī)制可能需要進(jìn)一步研究。

本研究觀察了Mdr1a 對BMA 在小鼠體內(nèi)的組織分布和血漿藥動學(xué)影響，并通過小鼠在體腸灌流實驗進(jìn)一步研究了Mdr1a 對BMA 腸吸收的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，靜脈注射1 mg·kg-1BMA 2 h 后，與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠膽汁中BMA 的蓄積量降低了86.26%（P＜0.05）。與野生型FVB 小鼠相比，靜脈注射1 mg·kg-1BMA 2 h 后，Mdr1a-/-小鼠腦、心臟、腎臟、小腸和結(jié)腸中BMA 濃度均顯著升高（P＜0.05）。與野生型FVB 小鼠相比，除消化器官外，BMA 的濃度在Mdr1a-/-小鼠中各器官的升高程度呈現(xiàn)腦＞腎臟＞心臟的趨勢。與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠靜脈注射BMA 0.5 或2 h 后，腦和心臟中BMA 的濃度均顯著上升，該結(jié)果與毒性研究中的BMA 含量測定結(jié)果一致。大腦是烏頭類生物堿中毒的首要靶器官，中毒者常出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性癥狀[25]。BMA 在Mdr1a-/-小鼠腦中積累的增加為其鎮(zhèn)痛作用的增強(qiáng)和神經(jīng)毒性的加劇提供了很好的解釋。心臟不是MDR1 表達(dá)最為豐富的器官，MDR1主要分布在腦、小腸和腎臟中[16]。因此，BMA 在Mdr1a-/-小鼠心臟中的濃度增加程度小于其在腦組織中，這可能也解釋了BMA 在心臟中的蓄積不會產(chǎn)生類似神經(jīng)毒性那么明顯的原因。

Mdr1a 也分布在腎臟的刷狀緣膜上，對藥物的腎臟排泄有一定的影響[16]。本研究結(jié)果表明，腎臟是BMA 的主要分布和排泄器官。BMA 在腎臟中的消除比在其他器官中更慢，尤其是在Mdr1a-/-小鼠中，與FVB 小鼠相比，BMA 在腎臟中的濃度明顯升高，消除速度減慢。這一結(jié)果提示，當(dāng)MDR1 在體內(nèi)被抑制時，可能會增加BMA 致腎損傷的風(fēng)險。此外，與野生型FVB 小鼠相比，Mdr1a-/-小鼠血漿中BMA 濃度顯著升高，這是因為Mdr1a 外排轉(zhuǎn)運(yùn)的缺失，減少了BMA 外排至腸腔，從而增加了BMA 吸收入血。

在血漿藥動學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)Mdr1a 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的缺失顯著增加了BMA 在小鼠體內(nèi)的暴露量，并顯著減緩了BMA 的消除速率。與野生型FVB 小鼠相比，BMA 在Mdr1a-/-小鼠體內(nèi)的生物利用度增加4.53 倍，tmax、AUC0-t和AUC0-∞顯著增加，Vd值和Cl顯著減少（P＜0.05）。作者認(rèn)為Mdr1a 可能不僅僅通過影響B(tài)MA 的體內(nèi)組織分布來影響B(tài)MA 的藥動學(xué)過程，基于Mdr1a 在腸道中廣泛分布的特性，Mdr1a還可能通過影響其吸收來影響B(tài)MA 的藥代動力學(xué)過程。胃腸道吸收是口服藥物發(fā)揮療效的重要前提，而吸收部位包括胃、小腸和大腸，其中小腸的吸收最為重要。體內(nèi)腸灌流模型是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的用于研究藥物吸收特性的腸吸收模型，該模型接近藥物在體內(nèi)的真實吸收狀態(tài)[26]。在BMA 的腸道處置研究中，與FVB 小鼠相比，BMA 在Mdr1a-/-小鼠十二指腸中的吸收顯著增加，Peff值增加了約4 倍，這一結(jié)果與血漿藥動學(xué)實驗結(jié)果一致（BMA 在Mdr1a-/-小鼠體內(nèi)的生物利用度增加了約4.5 倍）。結(jié)合對腸灌流實驗、藥代動力學(xué)、藥效和毒性實驗結(jié)果的分析，Mdr1a 可通過影響B(tài)MA 的腸吸收來調(diào)節(jié)BMA 的體內(nèi)暴露，進(jìn)而調(diào)控其毒效。BMA 在Mdr1a-/-小鼠中吸收程度的增加，鎮(zhèn)痛作用的增強(qiáng)和神經(jīng)毒性的加劇，預(yù)示著可能引起具有臨床意義的藥效增加或不良反應(yīng)發(fā)生[27-28]。

綜上所述，Mdr1a 通過改變BMA 的組織蓄積、體內(nèi)暴露量和腸道吸收，參與調(diào)節(jié)BMA 的鎮(zhèn)痛作用和神經(jīng)毒性。然而，BMA 的抗炎作用和心肌毒性可能與Mdr1a 的缺失無關(guān)，后續(xù)實驗應(yīng)建立多種炎癥模型和應(yīng)用心肌毒性評價指標(biāo)綜合驗證Mdr1a 對BMA 抗炎作用和心肌毒性的影響。本研究在小鼠上證實了Mdr1a 對BMA 的藥效和毒性的調(diào)控作用，為附子的質(zhì)量控制、療效發(fā)揮、安全用藥和研發(fā)應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)，并提示使用附子時，應(yīng)注意配伍藥物是否為潛在的Mdr1a 抑制劑，但是關(guān)于BMA 與Mdr1a 抑制劑聯(lián)合用藥的藥物-藥物相互作用的研究有待進(jìn)一步探討。