劉亞敏，張明昊，王瑾瑾，白莉，王燦（. 河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046；. 河南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，河南 鄭州 450046）

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見的婦科內(nèi)分泌疾病，常見的臨床表現(xiàn)主要有排卵異常、高雄激素、卵巢呈現(xiàn)多囊樣改變及胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）等[1-2]。根據(jù)其特征，中醫(yī)臨床常將PCOS 歸為“不孕”“經(jīng)遲”“閉經(jīng)”“崩漏”等范疇，普遍認為其病因病機與腎虛、脾虛、肝郁、血瘀、沖任損傷、天癸失序、痰瘀胞宮等有關(guān)[3-4]。針對腎虛血瘀病機，多采用補腎活血化瘀的治法[5-9]。四物湯由當歸、川芎、白芍、熟地黃四味中藥組成，是養(yǎng)血補血活血的經(jīng)典方[10-11]。臨床研究[12]表明，四物湯合五子衍宗方加減能夠改善PCOS 患者臨床癥狀，縮短月經(jīng)周期，提高妊娠率。卵巢顆粒細胞在維持卵巢功能方面有重要作用，四物湯能促進顆粒細胞增殖，改善PCOS 大鼠卵巢功能[13-14]。研究[15]還發(fā)現(xiàn)，當歸水提物能通過改善高雄激素狀態(tài)、減輕炎癥反應和提高抗氧化水平達到治療PCOS 的目的。四物湯可通過糾正PCOS 大鼠血清激素水平，一定程度上恢復下丘腦-垂體-卵巢性腺軸功能，改善卵巢排卵功能[16]。IR 是PCOS 的主要癥狀之一，而肝激酶B1（LKB1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路與IR 密切相關(guān)[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠顯著改善PCOS 大鼠的IR，調(diào)節(jié)性激素水平，修復卵巢病理改變，其機制可能與調(diào)節(jié)LKB1/AMPK 通路有關(guān)。故本研究擬基于LKB1/AMPK 通路探討四物湯對PCOS 大鼠的治療作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 動物SPF 級健康雌性SD 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量（190±10）g，購自鄭州市惠濟區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠分籠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學醫(yī)學機能實驗室，大鼠自由飲水、攝食，適應性喂養(yǎng)1 周后開始實驗。本實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批，批文號：DWLL202201010。

1.2 藥物及試劑四物湯由當歸9 g、川芎6 g、白芍6 g、熟地黃12 g 組成，藥材購自鄭州真心大藥房股份有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學藥學院陳隨清教授鑒定均為正品。冷水浸泡藥材30 min 后，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煎煮30 min，共煎煮3 次，合并藥液并濃縮為1 g·mL-1四物湯水煎液。

來曲唑（批號：C12785740），上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸二甲雙胍片（批號：20031702），上海壽如松藥業(yè)泌陽制藥有限公司；達英-35（批號：KT062FL2），德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司；伊紅染色液、蘇木素染色液（批號分別為：20211009、190805），福州飛凈生物科技有限公司；氨基甲酸乙酯（批號：20210902），天津市光復科技發(fā)展有限公司；葡萄糖（Glu）、胰島素（Insulin）、雌二醇（Estrogen，E2）、睪酮（Testosterone，T）、促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）、促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）、促卵泡素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（批號分別為：F006-1-1、H203-1-2、H102-1、H090-1-2、H297、H206-1-2、H101-1-2），均購自南京建成生物工程研究所；DAB顯色試劑盒、兔SP 試劑盒（批號分別為：ZLI-9018、SP-9001），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TriQuick 總RNA 提取試劑、cDNA 合成試劑盒、實時熒光定量PCR 擴增試劑（批號分別為：R1100、G3330、G3320）及兔抗大鼠LKB1、AMPK抗體（批號分別為：GB111236、GB111919），武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器BS110S 型電子天平，北京賽多利斯天平公司；RM2235 型石蠟切片機，德國Leica 公司；MR-96TB 型酶標儀，騁克儀器（上海）有限公司；YD-6D 型組織包埋機、YD-A 型組織攤片機、YD-B 型組織烤片機，金華市科迪儀器設備有限公司；D3024R 型臺式高速冷凍型微量離心機，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；Stepone plus 型熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司；CX23 型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.4 模型復制將50 只雌性SD 大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為正常組（10 只）、造模組（40 只）。正常組大鼠灌胃0.1% CMC-Na 溶液，造模組大鼠灌胃來曲唑混懸液，每日1 次，連續(xù)灌胃21 d。造模第16 天開始進行陰道涂片觀察，光鏡下可觀察到大鼠陰道上皮細胞持續(xù)角化者為造模成功[19-20]。

1.5 分組及給藥將造模成功的大鼠隨機分為模型組、達英-35+二甲雙胍組（0.2+230 mg·kg-1）和四物湯低、中、高劑量組（1.62、3.24、6.48 g·kg-1），每組10 只。四物湯、達英-35、二甲雙胍的成人（70 kg）用量分別為36 g、2 mg、2.55 g，根據(jù)人與大鼠劑量換算公式（S200g大鼠=0.018×S70kg人）計算，四物湯、達英-35、二甲雙胍的大鼠給藥劑量分別為3.24 g·kg-1、0.2 mg·kg-1、230 mg·kg-1。本實驗以等效劑量3.24 g·kg-1為四物湯中劑量，以中劑量的0.5、2 倍作為四物湯低（1.62 g·kg-1）、高（6.48 g·kg-1）劑量；以0.2、230 mg·kg-1分別為達英-35、二甲雙胍給藥劑量。上述藥物均灌胃給藥（10 mL·kg-1），正常組和模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水，每日1 次，連續(xù)30 d。

1.6 取材及處理各組大鼠禁食12 h 后，稱體質(zhì)量，腹腔注射1 g·kg-1氨基甲酸乙酯麻醉大鼠；腹主動脈取血，以3 000 r·min-1（離心半徑=10 cm）離心10 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱。然后摘取卵巢，去除周圍組織，用生理鹽水洗滌；觀察卵巢外觀形態(tài)，用濾紙吸盡臟器表面液體后，稱定質(zhì)量；將卵巢組織分為2 份，1 份用4%多聚甲醛溶液固定后用于組織病理學分析，另1 份用液氮速凍后，-80 ℃保存。

1.7 ELISA 法檢測大鼠血清中血糖、胰島素、E2、T、GnRH、FSH、LH 水平取“1.6”項下制備的血清，室溫下解凍后，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作，檢測血糖、胰島素、E2、T、GnRH、FSH、LH 水平，并計算：IR 指數(shù)=空腹血糖值×空腹胰島素值/22.5。

1.8 大鼠卵巢系數(shù)測定計算：大鼠卵巢系數(shù)=卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量，依據(jù)卵巢系數(shù)評價卵巢病變程度。

1.9 大鼠卵巢組織病理形態(tài)學觀察取“1.6”項下固定后的卵巢組織，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色、梯度乙醇脫水、中性樹膠封片等步驟，在光學顯微鏡下觀察病理切片，并采集圖像。

1.10 免疫組織化學法檢測大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK 蛋白表達水平取“1.9”項下制備的卵巢組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，用檸檬酸鹽緩沖液熱修復8 min；待溫度降至室溫后依次用H2O2孵育10 min，PBS 浸洗，山羊血清孵育30 min；然后滴加LKB1（1∶2 000）、AMPK（1∶1 000）抗體，4 ℃下孵育過夜；次日，切片復溫至37 ℃后，滴加生物素標記的羊抗兔二抗，孵育20 min；PBS 浸洗，DAB 顯色10 min后，自來水沖洗終止；然后蘇木素復染3 min，鹽酸乙醇分化，自來水再次沖洗；切片經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后鏡檢。每只大鼠卵巢切片在400 倍鏡下隨機選取1 個視野，以棕黃色為陽性染色；采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測定每個視野中的積分光密度（Integrated Optical Density，IOD）值，并進行統(tǒng)計分析。

1.11 實時熒光定量PCR 法檢測大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA 表達水平根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫公布的大鼠LKB1（登錄號：NM001108069.1）、AMPK（登錄號：NM023991）、GAPDH（登錄號：NM017008.4）基因序列，采用DNAStar 軟件包的PrimerSelect 程序設計特異性引物，并由武漢塞維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表1。取大鼠卵巢組織100 mg，加入1 mL TriQuick 試劑充分研磨勻漿后提取總RNA，檢測RNA 濃度及純度。在20 μL反應體系內(nèi)合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 s；再以2 μL cDNA 為模板，加入靶基因上下游引物于15 μL 反應體系內(nèi)進行PCR 擴增，擴增條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進行40 個循環(huán)；反應結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線及熔解曲線判斷PCR 反應特異性。結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平，并進行統(tǒng)計分析。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.12 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 法，方差不齊者采用Dunnett’s 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四物湯對PCOS 大鼠血糖、胰島素水平及IR指數(shù)的影響結(jié)果見圖1。與正常組比較，模型組大鼠的血糖、胰島素水平及IR 指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，達英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠的血糖、胰島素水平及IR指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能降低PCOS 大鼠的血糖、胰島素水平。

圖1 四物湯對多囊卵巢綜合征大鼠血糖、胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)的影響（±s，n=10）Figure 1 The effect of Siwu Decoction on the levels of blood glucose and insulin and insulin resistance index in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.2 四物湯對PCOS 大鼠血清E2、T、GnRH、FSH、LH 水平的影響結(jié)果見圖2。與正常組比較，模型組大鼠血清中T、GnRH、LH 水平明顯升高（P＜0.05），E2、FSH 水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，達英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠血清中GnRH、LH 水平明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)SH 水平明顯升高（P＜0.05）；達英-35+二甲雙胍組和四物湯中劑量組大鼠血清中E2水平明顯升高（P＜0.05），T 水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能升高PCOS 大鼠E2、FSH 水平，降低T、GnRH、LH 水平。

圖2 四物湯對多囊卵巢綜合征大鼠血清E2、T、GnRH、FSH、LH 水平的影響（±s，n=10）Figure 2 The effect of Siwu Decoction on the levels of E2，T，GnRH，F(xiàn)SH and LH in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.3 四物湯對PCOS 大鼠卵巢系數(shù)的影響結(jié)果見圖3。與正常組比較，模型組大鼠的卵巢系數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，達英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠的卵巢系數(shù)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能降低PCOS 大鼠的卵巢系數(shù)。

圖3 四物湯對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢系數(shù)的影響（±s，n=10）Figure 3 The effect of Siwu Decoction on ovarian coefficient in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.4 四物湯對PCOS 大鼠卵巢組織病理變化的影響結(jié)果見圖4。正常組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，各級卵泡數(shù)量較多，發(fā)育良好，存在正常黃體和白體。模型組大鼠卵巢皮質(zhì)膠原化，閉鎖卵泡及無卵丘的囊性卵泡數(shù)量增多，卵泡顆粒細胞層數(shù)少。達英-35+二甲雙胍組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)基本完整，各級卵泡形態(tài)完好，放射冠清晰，未見卵泡囊性改變，卵泡顆粒細胞層厚度增加，存在少量黃體和白體。四物湯低劑量組大鼠卵巢組織中可見較多的閉鎖卵泡和無卵丘囊性卵泡，卵泡顆粒細胞層數(shù)少；四物湯中、高劑量組大鼠卵巢組織內(nèi)含有各級卵泡，數(shù)量比例正常，顆粒細胞層厚度增加，放射冠清晰，存在少量黃體和白體，未見卵泡囊性改變。

圖4 四物湯對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織病理變化的影響（HE 染色，×100）Figure 4 The effect of Siwu Decoction on pathological morphology micrograph of ovaries in polycystic ovary syndrome rats（HE staining，×100）

2.5 四物湯對PCOS 大鼠卵巢組織LKB1、AMPK

蛋白表達水平的影響結(jié)果見圖5。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，達英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能上調(diào)PCOS 大鼠卵巢組織中的LKB1、AMPK 蛋白表達。

圖5 四物湯對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織LKB1、AMPK 蛋白表達水平的影響（免疫組化，×400；±s，n=10）Figure 5 The effect of Siwu Decoction on the protein expression levels of LKB1 and AMPK in polycystic ovary syndrome rats（IHC，×400；±s，n=10）

2.6 四物湯對PCOS 大鼠卵巢組織LKB1、AMPK mRNA 表達水平的影響結(jié)果見圖6。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，達英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能上調(diào)PCOS 大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA 表達。

圖6 四物湯對多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織LKB1、AMPK mRNA 表達水平的影響（±s，n=10）Figure 6 The effect of Siwu Decoction on the mRNA levels of LKB1 and AMPK in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

3 討論

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科常見的生殖功能障礙伴有糖代謝異常的內(nèi)分泌紊亂綜合征。其常見的臨床表現(xiàn)及主要病理特征有持續(xù)排卵異常、月經(jīng)紊亂、高雄激素、胰島素抵抗（IR）、卵巢呈現(xiàn)多囊樣改變、閉鎖卵泡及無卵丘的囊性卵泡數(shù)量增多、卵泡顆粒細胞層數(shù)及成熟卵泡減少[21]。目前研究PCOS 的常用動物模型的造模方法有類固醇造模法、雄激素造模法、來曲唑造模法等。其中來曲唑造模法應用較為廣泛，多項研究[22-23]將來曲唑造模法與其他造模法進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是從卵巢局部解剖學、形態(tài)學方面看，還是從性激素、蛋白表達水平方面比較，來曲唑造模法構(gòu)建的PCOS 動物模型都更接近PCOS 的典型臨床特征，且操作簡單，對動物創(chuàng)傷性小，是研究PCOS 較理想的動物模型[24]。本研究結(jié)果顯示，PCOS 模型大鼠卵巢稍增大且出現(xiàn)多囊性改變，血清T、GnRH 及LH 水平明顯升高，E2、FSH 水平明顯降低，且血糖、胰島素水平及IR指數(shù)明顯升高，表明造模成功。達英-35（炔雌醇環(huán)丙孕酮片）對PCOS 所致的高雄激素等癥狀有改善作用[25]，二甲雙胍可以改善IR[26]，臨床上常聯(lián)合使用達英-35 和二甲雙胍治療PCOS[27-28]。因此，本研究采用達英-35 聯(lián)合二甲雙胍作為陽性對照藥。

本研究結(jié)果顯示，四物湯能增加PCOS 大鼠卵巢組織內(nèi)各級卵泡數(shù)量，使囊性卵泡數(shù)量減少或消失，并且使顆粒細胞層增厚。PCOS 常常伴有卵泡排出障礙，導致卵巢增生[29]，而四物湯可以降低PCOS大鼠卵巢系數(shù)，緩解其增生進程。LH、FSH、E2和相應激素受體一起作用于卵巢，調(diào)控雌性機體的卵泡發(fā)育和排卵過程[30-31]。LH、FSH 的分泌受GnRH 的調(diào)控[32]。PCOS 患者分泌的GnRH 明顯增多，引起LH水平升高、FSH 水平下降，而LH 水平升高可刺激卵泡膜細胞生成大量T，而FSH 水平下降則會影響T向雌激素轉(zhuǎn)化的進程，從而導致卵巢內(nèi)高雄激素，妨礙優(yōu)勢卵泡的發(fā)育和排出，進而形成卵巢多囊樣改變[33-34]。同時，PCOS 患者分泌E2減少，也會導致卵泡閉鎖和排卵障礙[35-37]。本研究結(jié)果顯示，四物湯能升高PCOS 大鼠E2、FSH 水平，降低T、GnRH、LH 水平，表明四物湯對PCOS 大鼠的性激素分泌水平有一定的改善作用。

研究[38-40]發(fā)現(xiàn)，PCOS 常伴有IR，而LKB1/AMPK信號通路與IR 的產(chǎn)生相關(guān)。LKB1、AMPK 為真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達于各種組織。當細胞內(nèi)一磷酸腺苷（AMP）/三磷酸腺苷（ATP）比值升高時，AMP 與AMPK-γ 調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，磷酸化LKB1 為p-LKB1，p-LKB1 又與AMPK-α 亞基上的Thr172 位點結(jié)合，磷酸化該位點為p-AMPK，進而開啟分解代謝途徑以升高ATP 水平，同時關(guān)閉合成代謝途徑以降低ATP 消耗，維持能量平衡[41-42]。有研究[43-44]表明，LKB1、AMPK 蛋白表達水平降低是IR 發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而有氧運動與膳食干預則能提高LKB1、AMPK 蛋白表達水平，進而改善IR。因此，推測PCOS 引起的IR 與LKB1/AMPK 通路的下調(diào)有關(guān)。研究[45]還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以激活AMPK 通路，使糖酵解速度加快，提高胰島素敏感性。本研究結(jié)果顯示，PCOS 大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK蛋白及mRNA 表達水平明顯下降，即LKB1/AMPK通路被抑制，而四物湯可以明顯上調(diào)LKB1、AMPK蛋白及mRNA 表達水平，因此推測四物湯可能通過激活LKB1/AMPK 通路來發(fā)揮其對PCOS 的改善作用。

綜上所述，四物湯對PCOS 大鼠性激素水平、IR及卵巢囊性改變具有明顯改善作用，其機制可能與激活LKB1/AMPK 通路有關(guān)。本研究結(jié)果可為四物湯在PCOS 治療方面的深入開發(fā)利用提供新的實驗依據(jù)。