韓云鵬，田津，劉立石，劉文雅，王翼軒，閆亞男，方朝義（.河北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，河北 石家莊 050200；2.河北省中西醫(yī)結合肺病研究重點實驗室，河北 石家莊 05009）

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的纖維化性、慢性進行性間質肺炎，發(fā)病率呈增長趨勢，其病理特點為彌漫性肺泡炎，及肺泡上皮細胞損傷和異常修復所致的肺間質進行性纖維化，導致肺功能不可逆下降[1]，癥狀多見干咳、勞累性呼吸困難和疲勞等。該病的病因病機尚未完全明確，主要有炎癥反應、上皮細胞-間充質細胞轉化、氧化應激和相關信號傳導通路活化等相關學說[2-4]。IPF 屬于中醫(yī)學“肺痿”或“肺痹”范疇，臨床多為氣虛血瘀證型，常用補益肺氣、活血通絡之法[5]，補益肺氣有助于提高患者免疫功能，活血通絡則能改善肺臟微循環(huán)。補陽還五湯是補氣活血通絡的經(jīng)典名方，被廣泛用于IPF 的治療，且具有較好療效[6-8]。研究[9-13]發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能夠通過多環(huán)節(jié)、多通道、多靶點發(fā)揮抗肺纖維化的作用，與調控炎性因子表達、干預上皮間質轉化和內皮間質轉化、抑制成纖維細胞增殖、維持氧化/抗氧化平衡、調節(jié)血管生成、保護肺血管內皮細胞、促進自噬激活，以及調控TGF-β/Smad/ERK、HMGB1、PTEN/mTOR 相關信號通路等有關。氣虛引起推動血液運行能力下降，血瘀則致血流郁積于經(jīng)脈或器官而呈現(xiàn)凝滯狀態(tài)。故本研究擬通過觀察血液流變學指標及肺小動脈的形態(tài)變化，從微觀血瘀角度探討實驗性IPF 大鼠的氣虛血瘀狀態(tài)及補陽還五湯的干預作用。

1 材料與方法

1.1 動物6 周齡雄性SD 大鼠60 只，SPF 級，體質量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006，實驗動物質量合格證號：110011200107908327。大鼠飼養(yǎng)在標準動物房，自由進食標準飼料和純凈水。本動物實驗經(jīng)河北中醫(yī)學院倫理委員會審查，倫理批文號：DWLL2020086。

1.2 藥物及試劑補陽還五湯方劑組成：生黃芪120 g（批號：20200801）、當歸尾6 g（批號：20200630）、赤芍4.5 g（批號：088200901）、川芎3 g（批號：098191202）、紅花3 g（批號：20200701）、桃仁3 g（批號：20200912）、地龍3 g（批號：A190034001），每劑142.5 g，購自北京同仁堂藥店，上述藥材均經(jīng)河北中醫(yī)學院藥學院張丹教授鑒定合格。所有藥材以純凈水煎煮2 次，每次30 min，過濾去渣，藥液保存于冰箱備用。

注射用鹽酸博來霉素（Bleomycin，BLM），浙江翰暉制藥有限公司，批號：20 067411；乙磺酸尼達尼布膠囊，德國勃林格殷格翰公司，批號： 900678；戊巴比妥鈉，江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司，批號：57-33-0。HE、Masson 染色試劑盒，珠海貝索生物技術有限公司，批號分別為：BA-4097、BA-4079A；乙二胺四乙酸二鉀，北京華威銳科化工有限公司，批號：2001-94-7。

1.3 主要儀器LBY-N75008 型全自動血液流變儀，北京普利生儀器有限公司；Plus384 型酶標儀，美國Molecular Devices 公司；EG11508 型組織包埋機、HI1210 型攤片機、RM2255 型全自動輪轉式切片機，德國徠卡公司；BX53 型顯微鏡，日本Olympus公司；3K15 型高速冷凍離心機，德國Sigma 公司；WBP-RT4 型清醒動物肺功能檢測系統(tǒng)，法國EMKA科技公司。

1.4 分組、模型復制及給藥適應性喂養(yǎng)1 周后，將大鼠隨機分為4 組：對照組、模型組、尼達尼布組（0.1 g·kg-1）、補陽還五湯組（14.84 g·kg-1），每組15 只。采用氣管內滴注博來霉素建立IPF 大鼠模型[14]，具體操作如下：腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.04 g·kg-1）麻醉大鼠后，從頸部正中線切開皮膚，分開肌肉，暴露氣管；用1 mL 注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端刺入，緩慢滴注以生理鹽水溶解的博來霉素（5 mg·kg-1）；滴注完畢后，迅速將鼠板直立并旋轉，使藥物均勻分布在大鼠兩側肺部；對照組采用同樣方式滴注同等體積的去離子水。術后次日開始，除對照組外的其他各組均每日施加限制食量和睡眠剝奪刺激因素，以加重大鼠氣虛血瘀狀態(tài)。每日白天隨機進行睡眠剝奪4 h（反復敲擊鼠籠或更換鼠籠，以干擾其睡眠），20∶00 給予正常大鼠食量的2/3，連續(xù)干預28 d。大鼠于術后次日開始灌胃給藥[15]，補陽還五湯組給予補陽還五湯中藥煎液14.84 g·kg-1，尼達尼布組給予尼達尼布混懸液0.1 g·kg-1，對照組和模型組給予等體積去離子水10 mL·kg-1，每日1 次，連續(xù)28 d。

1.5 一般生物學表征比較觀察大鼠的精神狀態(tài)、皮毛色澤、攝食飲水、糞便、活動、呼吸等一般情況。重點觀察大鼠有無氣虛血瘀癥狀表現(xiàn)，如進食量減少，體質量降低，精神不振、喜蜷臥、喘息，活動性差，攻擊性、對抗性行為減少或消失，糞便軟或出現(xiàn)稀溏，毛發(fā)干燥無光澤，口唇、舌質色絳或紫暗，尾尖、尾根等部位出現(xiàn)青斑或皮下瘀紫，眼球更鮮紅或暗紅等[16]。分別于造模術前和術后第28 天對大鼠氣虛血瘀癥狀進行量化評分[17-20]，每只大鼠由4 名實驗人員獨立完成評分，最終取平均值納入統(tǒng)計分析。評分標準見表1。

表1 大鼠氣虛血瘀證候評價量表Table 1 Evaluation scale of qi deficiency and blood stasis syndrome in rats

1.6 大鼠肺組織病理形態(tài)學觀察將大鼠肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后，行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片機制備厚4 μm 組織切片，行HE、Masson 常規(guī)染色，在光學顯微鏡下觀察。HE 染色結果以Szapiel 評分體系評價肺泡炎性程度[14]，Masson 染色結果采用Ashcroft 評分體系評價大鼠肺組織纖維化情況[21]。分別在200 倍視野下，每組選取8 個視野進行評價，具體評分標準見表2、表3。

表2 Szapiel 評分體系Table 2 The Szapiel scoring system

表3 Ashcroft 評分體系Table 3 The Ashcroft scoring system

1.7 曠場實驗第0、7、14、28 天通過曠場實驗檢測大鼠行為學變化。實驗所用曠場箱底面為1 m×1 m的正方形，外圍高40 cm 擋板，形成一個無蓋箱體。曠場箱底面劃分為25 塊20 cm×20 cm 的正方形小格，貼近四壁的小格稱為“外周格”（共16 格），其余為“中央?yún)^(qū)”（共9 格），中央?yún)^(qū)最中心的1 個小格為“中心格”。實驗人員將大鼠輕輕放進中心格，30 s 后開始計時，觀察大鼠在5 min 之內的運動軌跡、運動總距離、進入中央?yún)^(qū)次數(shù)及進入中心格次數(shù)。

1.8 血液流變學檢測取大鼠股動脈血液2 mL 抗凝，常溫下靜置30 min 后，采用全自動血液流變儀檢測全血低切變率（10 s-1）、中切變率（60 s-1）、高切變率（150 s-1）、紅細胞壓積、聚集指數(shù)和電泳指數(shù)。

1.9 評估肺小動脈病理變化程度取“1.6”項下的HE 染色切片，在200 倍鏡下選取4 個視野，并以400 倍鏡放大。然后采用Image-pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算肺小動脈管壁厚度、血管外徑、管腔面積、血管總面積，并計算出肺小動脈管壁厚度與血管外徑比值（WT%）、管壁面積與血管總面積比值（WA%），取其平均值進行統(tǒng)計分析，以評價肺小動脈病理變化程度。

1.10 統(tǒng)計學處理方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗；若所測數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布及方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗中的多個獨立樣本的Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較則采用SNK-q檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 補陽還五湯對IPF 大鼠一般生物學表征及氣虛血瘀證候評分的影響造模前各組大鼠精神狀態(tài)良好，行動活潑，反應靈敏，皮毛光澤，攝食飲水、排便均正常，體質量差異不明顯。造模后大鼠呼吸淺快，繼而呼吸急促，甚至出現(xiàn)哮鳴音，鼻頭、口唇和爪甲紫暗，毛發(fā)日漸色暗干枯，后期有大量毛發(fā)脫落。給藥組大鼠經(jīng)藥物干預后，攝食量有所增加，呼吸較為平穩(wěn)，鼻頭、口唇和爪甲出現(xiàn)輕度紫暗，毛發(fā)枯黃掉落等現(xiàn)象減少。氣虛血瘀證候評分結果見圖1。與對照組比較，模型組大鼠氣虛血瘀證候評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，尼達尼布和補陽還五湯組大鼠的氣虛血瘀證候評分顯著下降（P＜0.01）。與尼達尼布組比較，補陽還五湯組大鼠的氣虛血瘀證候評分明顯下降（P＜0.05）。結果表明，補陽還五湯能夠明顯改善IPF 大鼠的氣虛血瘀癥狀，且效果優(yōu)于尼達尼布。

圖1 補陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠氣虛血瘀證候評分的影響（±s，n=15）Figure 1 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the score of qi deficiency and blood stasis syndrome in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.2 補陽還五湯對IPF 大鼠肺組織病理形態(tài)學變化的影響結果見圖2、圖3。對照組大鼠肺組織無明顯病理變化，結構清晰，肺泡壁完整、連續(xù)。與對照組比較，模型組大鼠肺組織結構紊亂，肺泡結構有不同程度破壞，肺泡腔及肺間質可見大量炎性細胞浸潤，肺間質中可見明顯的成纖維細胞聚集和大量的膠原沉積，Szapiel 評分及Ashcroft 評分均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，尼達尼布組和補陽還五湯組大鼠肺泡結構相對完整，炎性細胞浸潤、膠原沉積和成纖維細胞聚積明顯減輕，Szapiel 評分及Ashcroft 評分顯著降低（P＜0.01）。結果表明，補陽還五湯能夠改善IPF 大鼠肺組織的炎癥及纖維化程度。

圖2 補陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學變化的影響Figure 2 Effect of Buyang Huanwu Decoction on pathological changes of lung tissue in rats with idiopathic pulmonary fibrosis

圖3 補陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠肺組織Szapiel 評分、Ashcroft評分的影響（±s，n=8）Figure 3Effect of Buyang Huanwu Decoction on Szapiel and Ashcroft scores of lung tissue in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=8）

2.3 補陽還五湯對IPF 大鼠行為學變化的影響結果見圖4。與對照組比較，模型組大鼠第28 天的運動總距離、進入中央?yún)^(qū)次數(shù)及中心格次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，尼達尼布組及補陽還五湯組大鼠第28 天的運動總距離、進入中央?yún)^(qū)次數(shù)及中心格次數(shù)均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。與尼達尼布組比較， 補陽還五湯組大鼠第28 天的運動總距離明顯增加（P＜0.05）。

圖4 補陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠行為學變化的影響（±s，n=15）Figure 4 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the behaviors of rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.4 補陽還五湯對IPF 大鼠血液流變學指標的影響結果見圖5。與對照組比較，模型組大鼠的全血低切、中切和高切黏度及紅細胞壓積、聚集指數(shù)、電泳指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，尼達尼布組及補陽還五湯組大鼠的全血低切、中切和高切黏度及紅細胞壓積、聚集指數(shù)、電泳指數(shù)均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 補陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠血液流變學指標的影響（±s，n=15）Figure 5 Effect of Buyang Huanwu Decoction on hemorheology of rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.5 補陽還五湯對IPF 大鼠肺小動脈病理變化的影響結果見圖6。與對照組比較，模型組大鼠的肺小動脈管壁厚度、肺小動脈管壁厚度與血管外徑比值、管壁面積與血管總面積比值均顯著增加（P＜0.01），肺小動脈形態(tài)發(fā)生明顯改變，并且肺小動脈主要分布在肺間質，圍繞著肺小動脈有較多的肺間質增生。與模型組比較，尼達尼布組和補陽還五湯組大鼠的肺小動脈管壁厚度、肺小動脈管壁厚度與血管外徑比值、管壁面積與血管總面積比值均顯著降低（P＜0.01）。

圖6 補陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠肺小動脈病理變化的影響（HE 染色；±s，n=4）Figure 6 Effect of Buyang Huanwu Decoction on pathological changes of pulmonary arterioles in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（HE staining；±s，n=4）

3 討論

研究[22]表明，氣管內一次性或重復注入博來霉素可復制與人肺間質纖維化病理過程相似的動物模型，是目前研究特發(fā)性肺纖維化（IPF）的常用造模方法。氣管內注入博來霉素導致大鼠呈現(xiàn)肺纖維化病理改變的同時，還存在典型的氣虛血瘀狀態(tài)[23]，本研究采用氣管內滴注博來霉素結合限制食量及睡眠剝奪作為刺激因素[24-27]，構建了氣虛血瘀IPF 大鼠證候模型。本研究結果表明，模型大鼠逐漸出現(xiàn)肺泡實變和肺間質纖維化增生，Szapiel 評分、Ashcroft 評分均顯著升高，符合IPF 的主要病理特征[28-30]；大鼠喜蜷臥，大便質稀量多，毛發(fā)日漸枯槁無光澤，活動探索時間下降，呼吸淺快或急促，甚至出現(xiàn)哮鳴音，表現(xiàn)出氣虛相關癥狀；鼻頭、口唇和尾尖紫暗，或有瘀斑，血液流變學指標明顯改變，出現(xiàn)肺小動脈壁厚度增加、管腔變窄等病理變化，判斷為典型的血瘀之象；結合氣虛血瘀證候評分結果，表明IPF 大鼠出現(xiàn)明顯的氣虛血瘀狀態(tài)，模型復制成功。

補陽還五湯由生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，具有補氣活血、祛瘀通絡的功效，常用于氣虛血瘀型IPF 的治療。方中重用生黃芪為君藥，大補脾肺之氣，且寓培土生金之意，肺氣旺則助心行血之功益昌，血自流經(jīng)，瘀無由生，絡脈通，玄府暢。臣以當歸尾，其長于活血，兼可養(yǎng)血，在活血化瘀同時尚可化生新血。赤芍清熱涼血，活血祛瘀，助歸尾行血之力，使肺臟絡活氣寧；川芎活血行氣，走而不守，行散血瘀力強；桃仁活血祛瘀以通肺絡，潤燥滑腸以行腑氣，腑氣得通則肺氣自降，一藥而兼三用，其功皆在保肺；紅花亦可活血暢通肺絡以利玄府。使藥地龍通經(jīng)活絡，可疏通微小血管之瘀。全方共奏益氣活血、通絡開玄之效，為益氣活血之代表方，亦契合IPF 氣虛血瘀之病機。其益氣活血通絡以使肺臟氣血得到充盈，臟腑組織得以充養(yǎng)；活血祛瘀開玄，又能促進病理產(chǎn)物代謝，改善血液循環(huán)，從而緩解肺纖維化之“血瘀”表現(xiàn)。

本研究結果表明，補陽還五湯可顯著改善IPF大鼠肺組織病理變化以及氣虛血瘀狀態(tài)，可能與其降低全血黏度、抑制肺小動脈血管病變，從而增強肺功能有關。本研究從微觀血瘀角度觀察了補陽還五湯對IPF 大鼠的影響，可為臨床應用益氣活血法治療IPF 提供參考，但更深層次的作用機制有待深入研究。