胡珉華，馮元藍(lán)，周若愚，孫偉鵬，湯勝堯，任悅怡，嚴(yán)泓松，曾文星，馬路遙，姜自偉，黃楓（. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 50405）

異位骨化（Heterotopic ossification，HO），又稱骨化性肌炎，是一種在軟組織中產(chǎn)生異常骨組織和軟骨組織的疾病，可分為先天性異位骨化和獲得性異位骨化。在臨床上，獲得性異位骨化較為常見，通常由肢體損傷、關(guān)節(jié)置換術(shù)后、神經(jīng)系統(tǒng)損傷等創(chuàng)傷引起，好發(fā)于肘關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)等活動度較大的關(guān)節(jié)[1]。在病變的早期，異位骨化多表現(xiàn)為局部軟組織的疼痛、腫脹和膚溫升高，晚期由于關(guān)節(jié)附近異常骨組織的形成可造成關(guān)節(jié)功能活動受限，發(fā)生關(guān)節(jié)僵硬[2]，給患者帶來了生活上的不便和心理上的痛苦，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。目前，口服非甾體抗炎藥、外照射治療和手術(shù)切除異常骨組織是治療異位骨化的常規(guī)治療方法。然而，這些常規(guī)治療方法具有局限性。在臨床上，口服非甾體抗炎藥往往容易導(dǎo)致一些并發(fā)癥，如骨折不愈合的發(fā)生，對術(shù)后康復(fù)具有一定的影響；外照射治療由于其價錢昂貴的因素使一些患者難以負(fù)擔(dān)治療費(fèi)用；而手術(shù)治療在短期內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)異位骨的清除，但是術(shù)后存在復(fù)發(fā)的風(fēng)險[3-4]。因此，目前迫切需要一種安全有效的治療方法彌補(bǔ)這些常規(guī)治療的缺陷。

中藥由于價錢低、療效好、副作用少，安全系數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)在治療某些難治疾病方面具有優(yōu)勢。三七屬于五加科、人參屬植物的根莖，具有散瘀止血、消腫定痛的功效，常用于治療跌打損傷類傷科疾病[5]。三七總皂苷是從中藥三七提取出的主要活性成分，具有抗炎、降脂、抗腫瘤等現(xiàn)代藥理作用[6]。近年來，有研究[7-8]采用三七總皂苷的中成藥制劑（血栓通注射液、血栓通膠囊），聯(lián)合非甾體抗炎藥及二磷酸鹽以預(yù)防術(shù)后發(fā)生異位骨化，取得了較好的療效。但是對于三七總皂苷干預(yù)異位骨化的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制尚未有研究系統(tǒng)闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個新穎的研究領(lǐng)域，它將藥理學(xué)和藥效學(xué)相結(jié)合，通過分析各種復(fù)雜和多級相互作用的網(wǎng)絡(luò)，闡明了許多化合物的協(xié)同效應(yīng)和潛在機(jī)制。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)挖掘三七總皂苷的作用靶點(diǎn)，揭示其治療異位骨化的分子機(jī)制，為未來預(yù)防和治療異位骨化提供一定的研究思路。

1 資料與方法

1.1 三七總皂苷主要活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測在臨床上，常常靜脈滴注含三七總皂苷成分的中成藥制劑血栓通注射液來預(yù)防異位骨化的發(fā)生，因此三七總皂苷的單體成分不經(jīng)過胃腸道消化而直接入血發(fā)生作用，故本研究暫不考慮三七總皂苷各單體成分的口服利用度屬性，而考慮藥物含量對藥效的影響。查閱《中華人民共和國藥典》[9]發(fā)現(xiàn)，在三七總皂苷各成分中，三七皂苷R1 含量不低于5%、人參皂苷Rg1 含量不低25%、人參皂苷Re 含量不低于2.5%、人參皂苷Rb1 含量不低于30%、人參皂苷Rd 含量不低于5%；并且這5 種皂苷類單體成分總量占血栓通注射液（三七總皂苷）的85%以上，故本研究以上述皂苷類成分為載體展開網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。利用毒性遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http://ctdbase.org/）和人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）預(yù)測上述5 種皂苷成分的相關(guān)作用靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)匯總得到三七總皂苷成分相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2 異位骨化相關(guān)靶點(diǎn)和潛在治療靶點(diǎn)的收集以“Heterotopic ossifification”為關(guān)鍵詞在CTD 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫、基因疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（DisGeNET）（https://www.disgenet.org/）和美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information，NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索異位骨化發(fā)病相關(guān)的靶點(diǎn)，合并各數(shù)據(jù)庫的靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后與三七總皂苷成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得三七總皂苷干預(yù)異位骨化的潛在治療靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將三七總皂苷干預(yù)異位骨化的潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）中，設(shè)置條件：物種為“homo sapiens”，可信度為“medium confidence≥0.7”，進(jìn)行蛋白相互作用關(guān)系分析。將蛋白相互作用關(guān)系文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件進(jìn)行可視化分析得到PPI 網(wǎng)絡(luò)，并利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選出PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 基因本體（Gene Ontology，GO）分析和關(guān)鍵蛋白模塊構(gòu)建利用Cytoscape 3.9.0 軟件的MCODE插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化聚類分析，得到三七總皂苷治療異位骨化的關(guān)鍵蛋白模塊。利用Cluo GO 插件對關(guān)鍵蛋白模塊進(jìn)行GO-BP（Biological process）功能分析，選取P＜0.05 的BP 條目，得到關(guān)鍵蛋白模塊主要涉及的生物過程。利用微生信在線平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）對GO 分析的結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.5 基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析利用Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/）對潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，選取P＜0.01 的信號通路，得到三七總皂苷治療異位骨化參與的途徑。利用微生信在線平臺對KEGG 富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。為了分析信號通路與靶點(diǎn)成分之間相互作用關(guān)系，利用Cytoscape 3.9.0 軟件構(gòu)建活性成分-潛在治療靶點(diǎn)-信號通路可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到活性成分的3D 結(jié)構(gòu)，將其導(dǎo)入Chem3D 軟件進(jìn)行能量最小化，得到小分子的pdb文件；在PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中搜索關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用pymol 軟件刪除水分子和小分子配體，最后利用Auto vina 軟件將處理得到的活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，以分析關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分的作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 三七總皂苷主要活性成分與靶點(diǎn)預(yù)測三七總皂苷主要活性成分的結(jié)構(gòu)見圖1。通過CTD 數(shù)據(jù)庫、GeneCards 數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到378 個與三七總皂苷5 個主要活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)。其中得到三七皂苷R1 相關(guān)靶點(diǎn)91 個；人參皂苷Rg1 相關(guān)靶點(diǎn)134 個；人參皂苷Re 相關(guān)靶點(diǎn)296 個；人參皂苷Rb1 相關(guān)靶點(diǎn)259 個；人參皂苷Rd 相關(guān)靶點(diǎn)257 個。

圖1 三七總皂苷主要活性成分的結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of the active components of Panax notoginseng saponins

2.2 異位骨化相關(guān)靶點(diǎn)及潛在治療靶點(diǎn)的收集從CTD、GeneCards、DisGeNET 和NCBI 數(shù)據(jù)庫共檢索得到4 945 個異位骨化相關(guān)靶點(diǎn)，其中從CTD 數(shù)據(jù)庫中得到4 733 個靶點(diǎn)；從GeneCards 數(shù)據(jù)庫得到355 個靶點(diǎn)；從NCBI 數(shù)據(jù)庫得到21 個靶點(diǎn)；從DisGeNET 數(shù)據(jù)庫得到8 個靶點(diǎn)。將上述異位骨化相關(guān)靶點(diǎn)與三七總皂苷主要活性成分相關(guān)靶點(diǎn)取交集，共得到196 個潛在治療靶點(diǎn)（圖2）。

圖2 異位骨化和三七總皂苷的共同靶點(diǎn)Figure 2 Common targets of heterotopic ossification and Panax notoginseng saponins

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.9.0 軟件，隱藏游離節(jié)點(diǎn)得到三七總皂苷治療異位骨化的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3）。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中包含186 個節(jié)點(diǎn)（node）和1 700 條邊（Edge），顏色越深代表度（Degree）值越大，說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位越重要。選取網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)中度值、中介中心性（Betweenness Centrality， BC） 值、 接近中心性 （Closeness Centrality，CC）值大于中位數(shù)的靶點(diǎn)并篩選2 次，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)中26 個關(guān)鍵靶點(diǎn)（表1），這些關(guān)鍵靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用，主要包括絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（TP53）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、轉(zhuǎn)錄因子Jun（JUN）和白細(xì)胞介素6（IL-6）等。

表1 三七總皂苷治療異位骨化的關(guān)鍵靶點(diǎn)Table 1 Key targets of Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

圖3 三七總皂苷治療異位骨化的蛋白互作PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Protein-protein interaction network of Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

2.4 關(guān)鍵蛋白模塊的構(gòu)建及GO 分析利用MCODE插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行蛋白模塊聚類分析，共得到9 個蛋白模塊，其中評分最高的2 個蛋白模塊網(wǎng)絡(luò)是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白模塊。對這2 個關(guān)鍵蛋白模塊進(jìn)行GO-BP 分析，發(fā)現(xiàn)模塊1 的靶點(diǎn)蛋白主要涉及對化學(xué)刺激的反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控、內(nèi)皮細(xì)胞增殖的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控和血管相關(guān)平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)等生物過程；模塊2 的靶點(diǎn)蛋白主要涉及對機(jī)械刺激的反應(yīng)、對β-淀粉樣蛋白的反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞分化、成纖維細(xì)胞的調(diào)控和NIK/NF-kappaB 信號的正向調(diào)節(jié)等生物過程。這2 個關(guān)鍵蛋白模塊的生物過程主要與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管生長、應(yīng)激反應(yīng)等生理過程有關(guān)（圖4）。

圖4 MCODE 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)蛋白模塊聚類分析的結(jié)果Figure 4 Results of clustering analysis on PPI network protein modules by MCODE plugin

2.5 KEGG 分析通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對潛在治療靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析，得到20 組信號通路集群（圖5）。這些信號通路集群包含162 條不同的信號通路，其中有多條信號通路與炎癥反應(yīng)、成骨細(xì)胞分化、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)，包括PI3K/AKT 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、FoxO 信號通路、IL-17 信號通路等（表2）。信號通路與靶點(diǎn)成分之間的相互作用關(guān)系見活性成分-潛在治療靶點(diǎn)-信號通路可視化網(wǎng)絡(luò)（圖6）。

表2 三七總皂苷治療異位骨化的KEGG 分析Table 2 KEGG analysis of Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

圖5 三七總皂苷治療異位骨化潛在治療靶點(diǎn)的20 組信號通路集群Figure 5 Twenty signal pathway clusters of potential therapeutic targets for the treatment of heterotopic ossification with Panax notoginseng saponins

圖6 三七總皂苷治療異位骨化的活性成分-潛在治療靶點(diǎn)-信號通路可視化網(wǎng)絡(luò)Figure 6 Visualization network of active components-potential therapeutic targets-signal pathways for Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

2.6 分子對接本研究以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 為研究載體，以AKT1、TNF、TP53、CASP3、STAT3前5 個關(guān)鍵靶點(diǎn)為研究靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。結(jié)合能小于0，表示配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能小于-5 kJ·mol-1，表示配體與受體緊密結(jié)合。結(jié)果表明，關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分的結(jié)合能均小于-5 kJ·mol-1（圖7），表明關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

圖7 三七總皂苷治療異位骨化活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果熱圖Figure 7 Heat map of molecular docking results of active components and key targets of Panax notoginseng saponins in the treatment of heterotopic ossification

3 討論

異位骨化屬于中醫(yī)“瘀血痹”的范疇。中醫(yī)認(rèn)為，機(jī)體受到外傷后，筋脈、筋骨、皮肉、血絡(luò)受損，血液溢于脈外，成為離經(jīng)止血，故局部出現(xiàn)腫脹，瘀斑；瘀血凝滯，氣血瘀阻，筋骨失養(yǎng)，經(jīng)脈不通，不通則痛，故異位骨化形成過程中常常伴有疼痛；風(fēng)寒濕邪痹阻筋骨，久之筋縮肉萎，關(guān)節(jié)活動不利，故后期多發(fā)生關(guān)節(jié)僵硬的癥狀[10]。對于異位骨化的治療，中醫(yī)多主張治“血”，應(yīng)用活血化瘀、消腫止痛的治法，采用活血化瘀類中藥內(nèi)服、外治熏洗的策略，在臨床上往往取得良好的療效[11]。三七屬止血藥，首載于《本草綱目》，具有止血不留瘀，活血不耗氣的特點(diǎn)。三七總皂苷是中藥三七發(fā)揮活血化瘀活性的主要成分，有研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可以降低術(shù)后發(fā)生異位骨化的幾率、具有防止軟組織內(nèi)異位骨形成的作用[8]。

影響藥效發(fā)揮的一個重要的因素不僅與藥物中包含的活性成分有關(guān)，也與活性成分在藥物中的含量息息相關(guān)。因此本研究從藥量的角度考慮三七總皂苷對異位骨化形成的影響。血栓通注射液中三七總皂苷的5 個活性成分的含量（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd）占總量的85%以上，可直接入血在體內(nèi)發(fā)揮作用。雖然目前并沒有證據(jù)表明三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd直接影響異位骨化的形成和發(fā)展，但有大量研究表明這些成分可以影響炎癥反應(yīng)。故我們猜測這些成分主要通過干預(yù)局部炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激來預(yù)防異位骨化的發(fā)生。炎癥反應(yīng)是影響異位骨化發(fā)生的重要因素，創(chuàng)傷后機(jī)體炎癥和低氧環(huán)境激活了Notch、TGF-β 和BMP 等信號通路，并促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化、血管發(fā)育和骨形成等過程，進(jìn)一步誘導(dǎo)了創(chuàng)傷性異位骨化的發(fā)生和發(fā)展[12]。三七皂苷R1 參與了氧化應(yīng)激和抗炎反應(yīng)的調(diào)節(jié)，當(dāng)發(fā)生脊髓損傷時，三七皂苷R1 可以激活Nrf2/HO-1 信號通路來減輕氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡、炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到減輕組織損傷和運(yùn)動神經(jīng)元損傷的目的，對于預(yù)防神經(jīng)源性異位骨化的發(fā)生具有重要意義[13]。人參皂苷Rg1 也具有抗炎的藥理作用，Zhang 等[14]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1 減輕了損傷組織的水腫與出血，減少炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死，修復(fù)了損傷組織；而且，人參皂苷Rg1 也顯著抑制了腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6 等炎癥因子的活性，減輕了創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)。人參皂苷Rb1 具有抗炎、抗氧化等藥理作用，人參皂苷Rb1 可以直接清除活性氧，保護(hù)組織免受氧化應(yīng)激損傷[15]。我們猜測，當(dāng)發(fā)生肢體創(chuàng)傷后，人參皂苷Rb1 可以干預(yù)局部的低氧環(huán)境，從而干預(yù)軟組織內(nèi)異位骨化的形成。人參皂苷Rd、人參皂苷Re 也參與調(diào)節(jié)了炎癥反應(yīng)，但它們在異位骨化上的作用還需進(jìn)一步研究。

通過對三七總皂苷治療異位骨化的PPI 網(wǎng)絡(luò)和蛋白模塊分析，我們篩選出26 個關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括AKT1、TNF、TP53、CASP3、STAT3、JUN、IL-6等。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)聚類分布于評分前兩位的關(guān)鍵蛋白模塊上，主要與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖等生理過程有關(guān)。AKT1 是與骨形成和發(fā)育密切相關(guān)的一種蛋白，既可以促進(jìn)成骨前體細(xì)胞分化，也可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成。在一項(xiàng)體內(nèi)研究[16]中，將小鼠的AKT1基因敲除后，可以觀察到實(shí)驗(yàn)組小鼠的破骨細(xì)胞活性明顯降低；破骨前體細(xì)胞生成減少；嚴(yán)重影響了骨組織的形成。另外，AKT1 與巨噬細(xì)胞極化有關(guān)，AKT1 的激活可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化，并分泌IL-10、TGF-β、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）、Fizz1、YM1 等抗炎因子，促進(jìn)炎癥消退、傷口愈合和組織修復(fù)[17]。我們猜測AKT1 通過類似的機(jī)制減輕了局部軟組織內(nèi)異位骨化形成過程中的炎癥反應(yīng)。在異位骨化的發(fā)病過程中，腫瘤壞死因子扮演著重要的角色。羅濤[18]對肱骨骨折術(shù)后各組TNF-α、BMP-2 和BMP-9 三種細(xì)胞因子在組織標(biāo)本的表達(dá)情況的觀察中發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后沒有發(fā)生異位骨化的患者一組中，TNF-α 顯著表達(dá)，而骨生長因子BMP-2 和BMP-9 的表達(dá)則顯著下降，證明在異位骨化中，TNF-α 與BMP 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 Mukai T 等[19]發(fā)現(xiàn)TNF-α 降低了骨鈣素、RUNX2 等成骨標(biāo)志物表達(dá)和堿性磷酸酶活性，在骨分化微環(huán)境中抑制了BMP 誘導(dǎo)的成骨分化。這說明了TNF-α 作為保護(hù)因子，對于異位骨化的預(yù)防和治療具有重要意義。STAT3 與神經(jīng)源性異位骨化的發(fā)生具有密切關(guān)系，研究者發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后那些發(fā)生異位骨化的小鼠的肌肉內(nèi)STAT3 的磷酸化顯著增加，然而通過抑制STAT3 的磷酸化，可以增加小鼠肌肉內(nèi)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，減少了肌肉組織中異位骨的體積，降低了異位骨化發(fā)生的概率[20]。IL-6 是一種與創(chuàng)傷性異位骨化發(fā)展相關(guān)的炎癥因子，一項(xiàng)前瞻性研究[21]發(fā)現(xiàn)，受到創(chuàng)傷后，發(fā)生異位骨化的患者血清中的IL-6 水平持續(xù)升高，并且IL-6 水平的升高與發(fā)生異位骨化的嚴(yán)重程度成正相關(guān)；另外，有研究[22]表明，IL-6 對異位骨化的形成具有促進(jìn)作用，IL-6 可激活BMP2、RUNX2、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（OSX）、骨鈣蛋白（OCN）等成骨細(xì)胞因子，從而參與胸椎異位骨化的形成。目前，并沒有研究[23]表明TP53、CASP3 和JUN 與異位骨化發(fā)生有關(guān)系，但有研究報道，這些靶點(diǎn)與骨形成和組織纖維化有關(guān)，可以參與異位骨化中纖維組織的形成。

通過GO 生物過程分析和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷主要通過PI3K/AKT、HIF-1、FoxO和IL-17 信號通路參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、成骨分化有關(guān)的生物過程來干預(yù)異位骨化的形成。PI3K/AKT 信號通路作為一條與細(xì)胞生長、增殖、炎癥反應(yīng)相關(guān)的信號通路，參與調(diào)控了異位骨化的成骨分化過程。在動物實(shí)驗(yàn)中，使用PI3K 抑制劑阻斷了PI3K/AKT 信號通路后，小鼠肌肉內(nèi)的軟骨基質(zhì)和骨量明顯減少， BMP2 誘導(dǎo)的異位骨化的成骨分化明顯受到抑制[24]；在一項(xiàng)體內(nèi)研究[25]中發(fā)現(xiàn)，大鼠肌腱源性干細(xì)胞（一種存在于肌腱生態(tài)位的前體細(xì)胞，創(chuàng)傷后的不正確分化導(dǎo)致肌腱鈣化）的成骨分化能力與PI3K/AKT 信號通路呈負(fù)相關(guān)；這些研究都表明PI3K/AKT 信號通路與異位骨的形成和發(fā)展密切相關(guān)。HIF-1 信號通路與異位骨化的缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)有關(guān)，由于缺氧環(huán)境是獲得性異位骨化發(fā)生必不可少的條件，當(dāng)組織受到創(chuàng)傷后，局部會形成缺氧微環(huán)境，缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）受到低氧刺激后被激活，從而調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)成骨前體細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞分化，在軟組織內(nèi)形成異位骨[26]。有研究[27]表明，HIF-1α 在肌腱切斷術(shù)后發(fā)生異位骨化的小鼠中高度表達(dá)，應(yīng)用HIF-1 抑制劑阻斷HIF-1信號通路后，上述小鼠軟組織內(nèi)異常骨組織的形成顯著減少，我們推測三七總皂苷通過HIF-1 信號通路干預(yù)創(chuàng)傷后組織缺氧環(huán)境下的成骨分化來干預(yù)異位骨化的形成。TNF 信號通路可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖來干預(yù)異位骨化的發(fā)生，有研究[28]發(fā)現(xiàn)長時間的TNF 治療可促進(jìn)體外脂肪來源干細(xì)胞分泌促炎因子IL-8，增加骨祖細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致軟組織內(nèi)形成異位骨；而且，研究[29]發(fā)現(xiàn)脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過TNF 干預(yù)后展現(xiàn)出更強(qiáng)大的成骨分化效能；這說明了TNF 信號通路對于異位骨化發(fā)生的重要意義。FOX 信號通路參與了細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期控制、葡萄糖代謝和抗氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，并且與發(fā)生異位骨化過程中的炎癥反應(yīng)相關(guān)；有研究發(fā)現(xiàn)FOX 轉(zhuǎn)染后的小鼠骨骼肌中的趨化因子和免疫細(xì)胞顯著上調(diào)，這種改變對控制骨骼肌內(nèi)炎癥反應(yīng)具有重要意義[30]。IL-17 信號通路通過調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境的成骨分化來調(diào)控創(chuàng)傷性異位骨化的形成，在這條通路上，IL-17 上游蛋白通過激活I(lǐng)L-17R/β-catenin 信號途徑（成骨細(xì)胞分化最重要的合成代謝信號通路之一）誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，并在體內(nèi)促進(jìn)創(chuàng)傷性異位骨化的發(fā)生；相反，通過抑制IL-17 信號通路可抑制異位骨的形成，從而防止發(fā)生異位骨化[31]。

我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法對三七總皂苷治療異位骨化的分子機(jī)制進(jìn)行了綜合分析，證明了三七總皂苷治療異位骨化是多成分、多靶點(diǎn)、多條通路共同作用的結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1 和人參皂苷Rd 是三七總皂苷治療異位骨化的有效成分，它們通過AKT1、TNF、TP53、CASP3、STAT3、JUN 和IL-6等靶點(diǎn)調(diào)控PI3K/Akt 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路、FoxO 信號通路、IL-17 信號通路等信號通路參與調(diào)控了炎癥反應(yīng)、骨細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化等生理過程來干預(yù)異位骨化的發(fā)展。以上的靶點(diǎn)和信號通路不僅為異位骨化的臨床治療提供了藥理學(xué)依據(jù)，也為治療異位骨化新藥的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。