張欽欽，曾夢楠，3，張貝貝，王茹，馮衛(wèi)生，3，鄭曉珂，3（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2. 河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046）

肺水腫是由于肺內(nèi)組織液的生成以及回流平衡失調(diào)，造成肺通氣與換氣功能嚴(yán)重障礙[1-2]，是急性肺損傷病理進(jìn)程中的中心環(huán)節(jié)，也是引起各種呼吸道疾病的重要因素，其發(fā)病迅速、死亡率高。隨著天然藥物研究的不斷發(fā)展，充分發(fā)揮其優(yōu)勢，積極找出安全有效的活性成分并闡明其作用機(jī)制，可能可為治療肺水腫提供新的思路?；⒄溶帐侵兴幓⒄鹊闹饕钚猿煞?，具有抗炎、鎮(zhèn)咳、抗氧化應(yīng)激及抗癌等多種藥理作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，虎杖苷對慢性阻塞性肺疾病大鼠有一定改善作用，可能與抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)[4]；虎杖苷還能夠減輕哮喘小鼠的氣道炎癥，其作用機(jī)制可能與SIRT1/NF-κB 通路有關(guān)[5]。角叉菜膠是一種具有較強(qiáng)致炎作用的硫酸多糖物質(zhì)，胸腔注射角叉菜膠后，能夠促進(jìn)釋放多種促炎因子[6]，造成局部血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，出現(xiàn)肺損傷和肺水腫。故本研究擬觀察虎杖苷對角叉菜膠致肺水腫大鼠的干預(yù)作用，及其對水通道蛋白1（AQP1）通路的影響，以期為虎杖苷治療肺水腫的相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性SD 大鼠50 只，SPF 級，體質(zhì)量180～220 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級動(dòng)物房中，12 h 光照，恒溫24 ℃，自由攝食、飲水，實(shí)驗(yàn)單位動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2020-0004。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批文號(hào)：DWLL2018080003。

1.2 藥物及主要試劑虎杖苷（貨號(hào)：SP8420）、活性氧（ROS）檢測試劑盒（批號(hào)：CA1410），北京索萊寶科技有限公司；醋酸地塞米松片，上海金不換蘭考制藥有限公司，批號(hào)：20 201006；Annexin V-PE/7-AAD 凋亡試劑盒，美國BD 公司，批號(hào)： 559763；角叉菜膠，美國Sigma 公司，批號(hào)C1013-25G；免疫球蛋白E（IgE，貨號(hào)：E-EL-R0517c）、白細(xì)胞介素4（IL-4，貨號(hào)：E-EL-R0014c）、干擾素γ（IFN-γ，貨號(hào)：E-EL-R0009c）檢測試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶（T-SOD，貨號(hào)：A001-1-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px，貨號(hào)：A005-1-2）及丙二醛（MDA，貨號(hào)：A003-1-1）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；HiScript III RT SuperMix（貨號(hào)： R323- 01）、 2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（貨號(hào)：Q711-02），南京諾維贊生物科技股份有限公司；CD11b-APC（批號(hào)： 2311195）、 Ly6G- FITC（批號(hào)： 2440387）、CD11b-FITC（批號(hào)：2172513）、F4/80-PE（批號(hào)：2142861）抗體，均購自美國Invitrogen 公司；AQP1（貨號(hào)：A15030）、AQP5（貨號(hào)：A13861）、IL-1β（貨號(hào)：A19635）、IL-10（貨號(hào)：A12255）以及β-actin（貨號(hào)：AC026）抗體，均購自武漢愛博泰克（ABclonal）生物科技有限公司。

1.3 主要儀器1905108 型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；BD FACS Aria Ⅲ型流式細(xì)胞儀，美國BD公司；Odessey 雙色近紅外成像系統(tǒng)，美國LI-COR公司；ABI QuantStudio 5 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)，美國Thermo Fisher 公司；PowerPacTM通用電泳儀、Trans-Blot?TurboTM半干轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司；Centrifuge-5804R 型小型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；MX63 型顯微鏡，日本Olympus公司。

1.4 分組、給藥及模型復(fù)制將50 只SD 大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、地塞米松組（0.075 mg·kg-1）及虎杖苷低、高劑量組（20、40 mg·kg-1），每組10 只。先按照上述劑量灌胃給藥，對照組和模型組給予同等體積的蒸餾水，每日1 次，連續(xù)灌胃給藥7 d。給藥結(jié)束后，除對照組胸腔注射同等體積生理鹽水外，其他各組大鼠從肋間肌處向胸膜腔注射1%角叉菜膠（20 mg·kg-1）溶液致炎48 h，建立肺水腫大鼠模型[7]，然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.5 測定大鼠肺組織含水量摘取大鼠肺組織，用生理鹽水清洗后，用濾紙拭干表面液體；用天平精確稱量左肺濕質(zhì)量，然后將左肺組織在真空干燥箱中烘干72 h 至恒重，取出后準(zhǔn)確稱量肺組織干質(zhì)量；計(jì)算：肺組織濕/干質(zhì)量比=肺濕質(zhì)量/肺干質(zhì)量，肺組織含水量（%）=（肺濕質(zhì)量-肺干質(zhì)量）/肺濕質(zhì)量×100%。

1.6 肺組織病理學(xué)觀察取大鼠右肺上葉組織，于4%多聚甲醛固定液中浸泡24 h 后，采用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5 μm 薄片；二甲苯脫蠟，乙醇梯度洗脫后，進(jìn)行HE 常規(guī)染色，封片后在顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織原代細(xì)胞凋亡及ROS水平取各組大鼠右肺下葉相同部位肺組織適量，經(jīng)胰酶消化后，加入胎牛血清終止消化，用70 μm濾網(wǎng)過濾收集肺組織原代細(xì)胞；分別嚴(yán)格按照ROS試劑盒和細(xì)胞凋亡試劑盒說明書步驟操作，染色后采用流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠肺組織原代細(xì)胞凋亡及ROS 水平。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測肺組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平取各組大鼠右肺中葉相同部位肺組織適量，PBS 洗滌后剪碎，以膠原酶Ⅱ消化；過濾后以500×g離心5 min，收集細(xì)胞，然后用紅細(xì)胞裂解液裂解，離心后用400 μL PBS 重懸；加入CD16/32 抗體阻斷Fc-γR，冰上孵育后，分別加入其相應(yīng)抗體（巨噬細(xì)胞：F4/80、CD11b 抗體；中性粒細(xì)胞：CD11b、Ly6G 抗體）；孵育后每管加入1 mL PBS 洗滌1 次，PBS 重懸細(xì)胞后采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 肺泡灌洗液中IgE、IL-4、IFN-γ 水平測定打開大鼠胸腔，結(jié)扎肺左支氣管，用PBS 重復(fù)灌洗右肺4 次，收集PBS 灌洗液，以3 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心10 min，取上清液，即得肺泡灌洗液。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，采用ELISA 法檢測肺泡灌洗液中IgE、IL-4 和IFN-γ水平。

1.10 肺組織中MDA、GSH-Px、T-SOD 水平測定取各組大鼠右肺相同部位肺組織適量，制備肺組織勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，測定肺組織中MDA、GSH-Px、T-SOD 水平。

1.11 RT-qPCR 法檢測肺組織AQP1、AQP5、IL-10、TNF-α、IL-13 mRNA 表達(dá)取各組大鼠左肺相同部位肺組織適量，提取總RNA；使用HiScript III RT SuperMix 預(yù)混液進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA；最后采用ChamQ 通用SYBR qPCR 預(yù)混液，以GAPDH 為內(nèi)參基因，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對AQP1、AQP5、IL-10、TNF-α 和IL-13 的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行分析；采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA 相對表達(dá)量。引物由武漢塞維爾生物有限公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.12 虎杖苷與AQP1 分子對接采用分子對接驗(yàn)證虎杖苷與潛在靶點(diǎn)AQP1 之間的相互作用關(guān)系。通過Chem Office 軟件繪制虎杖苷3D 結(jié)構(gòu)；通過PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）下載AQP1 蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，PDB 編號(hào)為8CTE；采用PyMOL 軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、提取配體等處理；利用AutoDock 軟件將關(guān)鍵蛋白及化合物的pdb 格式轉(zhuǎn)換為pdbqt 格式，并尋找活性口袋；最后通過AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。

1.13 免疫組化法測定肺組織中AQP1 蛋白表達(dá)將新鮮肺組織標(biāo)本經(jīng)組織固定液固定后制成蠟塊，切片（5 μm），然后脫蠟、水化；檸檬酸鹽緩沖液回收抗原，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶20 min；沖洗后微波加熱修復(fù)抗原，3% BSA 封閉30 min；滴加AQP1 一抗（1∶200）后，于4 ℃下孵育過夜；洗滌，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫下孵育1 h；DAB 顯色，蘇木精復(fù)染3 min；將切片依次經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、晾干后，中性樹膠封片；顯微鏡下觀察并采集圖像進(jìn)行分析。

1.14 Western Blot 法檢測肺組織中AQP1、AQP5、IL-1β、IL-10 蛋白表達(dá)取各組大鼠左肺相同部位肺組織適量，按照總蛋白提取試劑盒說明書步驟提取肺組織總蛋白；采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；用5%封閉液封閉1.5 h 后，回收封閉液；加入一抗AQP1（1∶1 000）、AQP5（1∶1 000）、IL-1 β（1∶1 000）、IL-10（1∶1 000）、β-actin（1∶25 000）后，室溫下孵育2.5 h，用PBST 洗滌4 次，每次5 min；加入兔源熒光二抗（1∶20 000），室溫下避光孵育1 h 后，用PBST 洗滌3 次，PBS 洗滌1 次；采用Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

1.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 法；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比及含水量的影響結(jié)果見表2。與對照組相比，模型組大鼠的肺組織濕/干質(zhì)量比及含水量明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），說明肺水腫大鼠模型復(fù)制成功。與模型組比較，虎杖苷高、低劑量組大鼠的肺組織濕/干質(zhì)量比及含水量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比及含水量的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of polydatin on wet/dry mass ratio of lung and lung water content in rats with pulmonary edema（x ± s，n=6）

表2 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織濕/干質(zhì)量比及含水量的影響（±s，n=6）Table 2 Effects of polydatin on wet/dry mass ratio of lung and lung water content in rats with pulmonary edema（x ± s，n=6）

注：與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

劑量/（mg·kg-1）濕/干質(zhì)量比2.10±0.29 2.50±0.15##2.14±0.17*2.14±0.23*1.89±0.30**組別對照組模型組地塞米松組虎杖苷低劑量組虎杖苷高劑量組--0.075 20 40含水量/%51.6±6.68 59.9±2.43#53.1±3.57*52.8±4.91*46.0±9.32**

2.2 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織病理變化的影響結(jié)果見圖1。對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤和聚集，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)無滲出物，肺組織無明顯病變。與對照組比較，模型組大鼠肺組織可見明顯的氣道增厚，分泌物增多，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，有水腫液聚集。與模型組比較，虎杖苷高、低劑量組大鼠肺組織的病理變化均得到明顯改善。

圖1 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織病理變化的影響（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of polydatin on the lung histopathology in rats with pulmonary edema（HE staining，×200）

2.3 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織原代細(xì)胞凋亡水平的影響結(jié)果見圖2。與對照組相比，模型組大鼠肺組織原代細(xì)胞中的活細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.01），死細(xì)胞、凋亡細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，虎杖苷高劑量組大鼠肺組織原代細(xì)胞中的活細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.01），死細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.01），虎杖苷高、低劑量組的凋亡細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，虎杖苷能夠降低肺水腫大鼠肺組織原代細(xì)胞的凋亡水平。

圖2 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織原代細(xì)胞凋亡水平的影響（±s，n=3）Figure 2 Effect of polydatin on apoptosis of primary cells of lung tissue in rats with pulmonary edema（±s，n=3）

2.4 虎杖苷對肺水腫大鼠氧化應(yīng)激水平的影響結(jié)果見圖3、表3。與對照組相比，模型組大鼠肺組織原代細(xì)胞ROS 水平及肺組織MDA 水平顯著升高（P＜0.01），T-SOD、GSH-Px 水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，虎杖苷高、低劑量組大鼠肺組織原代細(xì)胞ROS 水平及肺組織MDA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），T-SOD、GSH-Px 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織原代細(xì)胞活性氧（ROS）水平的影響（±s，n=3）Figure 3 Effect of polydatin on reactive oxygen species（ROS）of primary cells of lung tissue in rats with pulmonary edema（±s，n=3）

表3 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of polydatin on oxidative stress in lung tissue of rats with pulmonary edema（±s，n=6）

表3 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織氧化應(yīng)激水平的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of polydatin on oxidative stress in lung tissue of rats with pulmonary edema（±s，n=6）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

GSH-Px/（U·mg-1）10.67±2.61 6.79±0.40##8.90±2.21**10.94±1.72*12.88±1.72**組別對照組模型組地塞米松組虎杖苷低劑量組虎杖苷高劑量組劑量/（mg·kg-1）--0.075 20 40 T-SOD/（U·mg-1）49.24±3.62 31.21±2.49##39.65±2.91**53.46±5.20**59.66±6.95**MDA/（nmol·mg-1）2.37±0.07 2.81±0.20##2.30±0.09**2.28±0.14**2.27±0.09**

2.5 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平的影響結(jié)果見圖4、表4。與對照組相比，模型組大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，虎杖苷高、低劑量組大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平顯著降低（P＜0.01）。

圖4 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平的影響Figure 4 Effects of polydatin on neutrophils and macrophages in lung tissue of rats with pulmonary edema

表4 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平的影響（±s，n=3）Figure 4 Effects of polydatin on neutrophils and macrophages in lung tissue of rats with pulmonary edema（±s，n=3）

表4 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平的影響（±s，n=3）Figure 4 Effects of polydatin on neutrophils and macrophages in lung tissue of rats with pulmonary edema（±s，n=3）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

中性粒細(xì)胞水平/%7.20±0.36 13.93±0.15##10.07±0.74**12.50±0.87*7.30±0.56**組別對照組模型組地塞米松組虎杖苷低劑量組虎杖苷高劑量組劑量/（mg·kg-1）--0.075 20 40巨噬細(xì)胞水平/%3.87±0.31 9.67±0.38##5.73±0.61**8.43±0.25**7.17±0.59**

2.6 虎杖苷對肺水腫大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響結(jié)果見表5。與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中IgE、IL-4 水平顯著升高（P＜0.01），IFN-γ 水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，虎杖苷高、低劑量組大鼠肺泡灌洗液中IgE、IL-4 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），IFN-γ 水平顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。

表5 虎杖苷對肺水腫大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of polydatin on inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid of rats with pulmonary edema（±s，n=6）

表5 虎杖苷對肺水腫大鼠肺泡灌洗液中炎癥因子水平的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of polydatin on inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid of rats with pulmonary edema（±s，n=6）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

IFN-γ/（pg·mL-1）118.68±11.81 81.85±8.33##98.70±18.16**95.83±12.01*103.88±5.15**組別對照組模型組地塞米松組虎杖苷低劑量組虎杖苷高劑量組劑量/（mg·kg-1）--0.075 20 40 IgE/（ng·mL-1）0.82±0.29 2.08±0.50##0.83±0.34**1.27±0.25**0.94±0.14**IL-4/（pg·mL-1）8.42±1.96 13.4±1.40##9.22±1.29**11.46±1.74*8.14±1.10**

2.7 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織AQP1、AQP5、IL-10、TNF-α、IL-13 mRNA 表達(dá)的影響結(jié)果見圖5。與對照組比較，模型組大鼠肺組織AQP1、AQP5、IL-10 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），TNF-α、IL-13 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，虎杖苷高、低劑量組大鼠肺組織AQP1、AQP5、IL-10 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），TNF-α、IL-13 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。

圖5 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織AQP1、AQP5、IL-10、TNF-α、IL-13 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 5 Effects of polydatin on mRNA expressions of AQP1，AQP5，IL-10，TNF-α and IL-13 in lung tissue of rats with pulmonary edema（±s，n=3）

2.8 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織AQP1 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖6、圖7?；⒄溶张cAQP1 分子對接的結(jié)合能為-7.9 kJ·mol-1，以結(jié)合能≤-5 kJ·mol-1為標(biāo)準(zhǔn)，表明虎杖苷與AQP1 靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。與對照組比較，模型組大鼠肺組織中AQP1 蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，虎杖苷高、低劑量組大鼠肺組織中AQP1 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖6 虎杖苷與潛在靶點(diǎn)AQP1 的分子對接模式Figure 6 Molecular docking mode for polydatin and AQP1 target

圖7 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織中AQP1 蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=6）Figure 7 Effect of polydatin on AQP1 protein expression in lung tissue of rats with pulmonary edema（±s，n=6）

2.9 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織中AQP1、AQP5、IL-1β、IL-10 蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖8。與對照組比較，模型組大鼠肺組織中AQP1、AQP5、IL-10 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），IL-1β 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，虎杖苷高、低劑量組大鼠肺組織中AQP1、AQP5、IL-10 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01），IL-1β 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）。

圖8 虎杖苷對肺水腫大鼠肺組織中AQP1、AQP5、IL-1β、IL-10 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 8 Effects of polydatin on protein expressions of AQP1，AQP5，IL-1β and IL-10 in lung tissue of rats with pulmonary edema（±s，n=3）

3 討論

肺水腫是指肺血管內(nèi)液體滲入到肺間質(zhì)或肺泡中導(dǎo)致肺血管外液量增多的病理狀態(tài)[8]，其發(fā)病迅速、死亡率高，治療不及時(shí)會(huì)導(dǎo)致病情惡化，甚至危及生命。研究表明，虎杖苷具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、鎮(zhèn)咳、降血脂、抗休克等藥理作用[9]，其能夠通過調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB 信號(hào)通路改善膿毒癥急性肺損傷[10]。研究[11]還發(fā)現(xiàn)，虎杖苷能夠降低高原肺水腫模型大鼠的肺動(dòng)脈高壓，改善肺血管收縮狀態(tài)及微循環(huán)，對抗低氧誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷，從而降低肺水腫程度。但虎杖苷對角叉菜膠致肺水腫的干預(yù)作用未見報(bào)道，因此本研究通過胸腔注射角叉菜膠復(fù)制肺水腫大鼠模型，探討了虎杖苷對肺水腫的干預(yù)作用及可能的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的肺組織濕/干質(zhì)量比及含水量明顯升高，可見明顯的肺泡結(jié)構(gòu)破壞及炎癥浸潤，表明通過角叉菜膠成功誘導(dǎo)建立了肺水腫大鼠模型[7]。細(xì)胞凋亡是機(jī)體炎癥調(diào)控的重要機(jī)制，在肺水腫發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[12]，氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要原因之一[13]，大量ROS 會(huì)引起機(jī)體代謝紊亂和器官衰竭，并對肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞直接造成氧化損傷，進(jìn)而侵襲肺間質(zhì)，導(dǎo)致肺水腫[14]。而虎杖苷能夠降低肺水腫大鼠肺組織原代細(xì)胞的凋亡水平及ROS 水平，降低肺組織MDA 水平，升高T-SOD、GSH-Px 水平，明顯降低肺組織濕/干質(zhì)量比及含水量，改善肺組織的病理變化。

肺水腫發(fā)生時(shí)，會(huì)引起肺部組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，中性粒細(xì)胞集聚在炎癥部位后，血液中的單核細(xì)胞被大量招募，然后分化為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是2 種重要的天然免疫細(xì)胞，具有很強(qiáng)的病原識(shí)別、清除和吞噬能力。在炎癥性疾病發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 能加重體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。研究[15]發(fā)現(xiàn)，AQPs 具有調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用，AQP1低表達(dá)與肺組織中IL-1β 釋放和中性粒細(xì)胞積聚、分泌有關(guān)。AQPs 是一組細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要作用，是維持體內(nèi)水液代謝平衡的分子學(xué)基礎(chǔ)[16]。研究表明，AQP1 是肺損傷的重要標(biāo)記物，AQP1 表達(dá)水平降低，肺損傷程度加深[17]，AQP5 與AQP1 相互協(xié)調(diào)對調(diào)節(jié)水分轉(zhuǎn)運(yùn)速率有著重要作用[18]。本研究結(jié)果表明，虎杖苷可上調(diào)肺水腫大鼠肺組織中的AQP1、AQP5 表達(dá)，降低中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞水平，抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 的釋放，提高抗炎細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10 的水平，進(jìn)而改善肺損傷。

綜上所述，虎杖苷與AQP1 靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，其對角叉菜膠誘導(dǎo)的肺水腫大鼠具有明顯改善作用，可能與其通過調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡水平，以及上調(diào)AQP1、AQP5 表達(dá)有關(guān)。