蘇欣欣 李曉陽 鄒丹 楊麗華

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。卵巢癌易于復發(fā)和轉移,具有很高的死亡率[1]。胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase, TYMS)是一種參與DNA復制和修復的酶[2]。目前有研究報道,TYMS在乳腺癌、肺癌、肝癌和前列腺癌中高表達且與不良臨床結果相關[3-6],但未見TYMS在卵巢癌中的研究報道。本研究以生物信息學分析為基礎,對EOC中TYMS的表達及其相關基因的生物學功能、信號通路進行分析。

資料與方法

一、資料

1.Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)是目前世界上最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺[7]。

2.cBioPortal數(shù)據(jù)庫(https://www.cbioportal.org/)是一個用于探索分析和可視化多維癌癥基因組學和臨床數(shù)據(jù)的開放源代碼平臺[8]。

3.STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/;version 11.0)是一個可用于預測和跟蹤蛋白質-蛋白質相互作用的網(wǎng)絡[9]。

4.DAVID軟件(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp; version 6.8)是一個集成了生物數(shù)據(jù),用于注釋,可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫[10]。GO分析闡明與基因相關的潛在生物過程(BP),分子功能(MF)和細胞成分(CC)。KEGG整合了大量由高通量實驗技術產(chǎn)生的實用數(shù)據(jù)庫資源。

5.Sangerbox(http://www.sangerbox.com/tool)工具是一個免費的在線數(shù)據(jù)分析平臺。

二、方法

1.Oncomine數(shù)據(jù)庫分析TYMS表達情況:本研究應用Oncomine 平臺分析TYMS在卵巢癌和正常卵巢樣本中的表達情況,輸入TYMS基因并設置為“ovarian cancer、mRNA或DNA、Differential Analysis Cancer vs.Normal Analysis”進行表達分析,其閾值為P值<0.05。

2.cBioPortal數(shù)據(jù)庫挖掘TYMS相關基因:本研究中cBioPortal用于挖掘TYMS在卵巢癌中的相關基因,選擇用于可視化和分析的研究,并設置為“Ovarian Serous Cystadenocarcinoma(TCGA, Nature 2011)、TYMS”,點擊“Network”,查看與TYMS基因關系密切的基因調控網(wǎng)絡圖,共有39個基因。

3.STRING數(shù)據(jù)庫構建TYMS相關基因的PPI網(wǎng)絡:本研究使用STRING構建TYMS及相關基因的PPI網(wǎng)絡,將TYMS及其相關基因導入“Multiple proteins”中,并設置為“Homo sapiens”,其閾值為交互關系置信度>0.4,獲取圖表。

4.DAVID軟件探究TYMS及相關基因生物學功能和通路:本研究使用DAVID軟件完成GO分析和 KEGG 通路分析。將TYMS及相關基因導入DAVID中,并設置為“OFFICIAL_GENE_SYMBOL、Homo sapiens”,選擇“GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT、KEGG_PATHWAY”進行富集分析,其閾值為P值<0.05,FDR<0.5。最后,富集分析結果通過Sangerbox 工具可視化。

結 果

一、Oncomine數(shù)據(jù)庫中TYMS在卵巢癌中的表達

Oncomine 數(shù)據(jù)庫關于卵巢癌中TYMS基因差異表達的研究文獻共13項,包括1043例標本。文章分別發(fā)表于國際Br J Cancer,Cancer Res,Clin Cancer Res,Cancer Sci等雜志,在Oncomine數(shù)據(jù)中對這13項研究結果進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),TYMS在卵巢癌中呈現(xiàn)高表達,且差異具有統(tǒng)計學意義,見圖1。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TYMS在卵巢癌中的表達

二、TYMS相關基因識別與PPI網(wǎng)絡構建

在cBioPortal數(shù)據(jù)庫中,卵巢癌中與TYMS密切相關的基因共39個,分別為ATIC、CCNA1、CCNE1、CDC45A、CDC45、CDC6、CDT1、CSNK2A1、CSNK2A2、DHFR、DHFR2、E2F1、E2F3、FBXO5、GART、MTR、MTRR、ORC1、PCNA、POLA1、POLA2、POLD1、POLD2、POLD3、POLD4、POLE、POLE2、POLE3、POLE4、POLG、POLG2、PRIM1、PRIM2、REV3L、RRM2、SLC25A32、TFDP2、TK1、TK2。STRING構建包括TYMS基因在內的40個基因的PPI網(wǎng)絡,圖中可直觀顯示各相關基因與TYMS的相互作用,見圖2。

圖2 卵巢癌中TYMS相關基因的蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡

三、TYMS及相關基因的功能富集分析

在DAVID中對TYMS及其相關基因進行GO功能和KEGG途徑富集分析。GO功能注釋顯示了豐富的生物過程,由BP、CC和MF組成。GO分析結果顯示,TYMS及其相關基因分別于BP中的細胞周期G1/S調控、DNA生物合成、氨基酸生物合成、DNA代謝、輔酶代謝、核苷酸的生物合成等過程有關;與CC中的核染色體、DNA聚合酶復合物和線粒體等細胞組分有關;與MF中的DNA結合、DNA聚合酶活性和核苷酸結合等分子功能有關。KEGG途徑富集分析顯示,TYMS及其相關基因包括嘧啶代謝、DNA復制、嘌呤代謝等代謝途徑,p53、NF-κB、Wnt、AMPK等信號通路,膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌、急性髓系白血病等惡性腫瘤,以及細胞周期、葉酸一碳池、鉑耐藥、HTLV-I感染等在內的58條KEGG通路,見圖3。

(A-C):GO terms of the top 39 genes positively correlated with TYMS, including biological processes(BP), molecular function(MF), and cellular component(CC);(D):KEGG pathway of the top 39 genes positively correlated with TYMS

四、挖掘TYMS上游調控基因E2F3

結合TYMS相關基因的GO功能和KEGG通路富集分析結果,發(fā)現(xiàn)TYMS基因的主要生物學功能包括調節(jié)細胞周期、細胞分化、細胞周期轉化、蛋白質合成等,其中調節(jié)有絲分裂細胞G1/S期轉化為排在第一位的細胞生物學功能,富集分析提示TFDP2、CCNE1、E1F1、E2F3為G1/S期轉化中的上調基因,見圖4,提示TFDP2、CCNE1、E1F1、E2F3可能為TYMS的上調基因,值得進一步研究。

圖4 細胞周期通路圖(紅框為富集分析上調基因)

討 論

TYMS在胸苷單磷酸(deoxy-thymidine monophosphate, dTMP)的生物合成中起關鍵作用。TYMS是一種74 kda蛋白,它形成一種同型二聚體,利用輔助因子ch2h4-葉酸催化脫氧尿苷一磷酸(deoxy-uridine monophosphate, dUMP)的還原甲基化生成dTMP。dTMP是DNA合成的基本底物。所以,抑制TYMS的表達會導致核苷酸失衡,進而導致細胞死亡[11],TYMS高表達可促進癌變[12],導致惡性腫瘤的發(fā)生[13]。

本研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn),TYMS在EOC癌組織中表達顯著高于正常卵巢組織中的表達,與其他學者在其他惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌和前列腺癌[3-6]等的研究報道一致。這一結果提示,TYMS高蛋白表達水平與EOC發(fā)生關系密切,在EOC的發(fā)生中可能扮演癌基因的作用。

為進一步探討TYMS在EOC中可能的作用機理。本研究通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫,獲得了EOC中與TYMS表達呈正相關的基因共39個,并在STRING數(shù)據(jù)庫中構建了TYMS相關基因的PPI網(wǎng)絡。通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能和KEGG通路富集分析,本研究發(fā)現(xiàn),TYMS的主要生物學功能為調節(jié)有絲分裂細胞G1/S期轉化、細胞周期、DNA生物合成、氨基酸生物合成、DNA代謝等,提示TYMS可能通過調節(jié)有絲分裂細胞G1/S期轉化、細胞周期、嘧啶代謝、DNA復制和堿基切除修復等通路,參與EOC的發(fā)生發(fā)展。

為了探討TYMS在EOC中高表達的原因,本研究還發(fā)現(xiàn)轉錄因子Dp-2(transcription factor dp-2, TFDP2)、細胞周期蛋白E1(cyclin e1, CCNE1)、E1F轉錄因子1(E1F transcription factor 1, E1F1)、E2F轉錄因子3(E2F transcription factor 3, E2F3)可能為TYMS的上調基因。首先,TFDP基因編碼一個轉錄因子家族,與E2F家族蛋白形成的E2F-TFDP轉錄因子異源二聚體是細胞周期S期進展所需基因的主要調節(jié)因子[14]。TFDP2或TFDP家族的其他成員可能通過與E2F家族成員合作來激活下游基因TYMS、CCNE1。例如,已有研究證實,在肝細胞癌中TYMS、CCNE1的表達水平與TFDP1和E2F1密切相關[15]。其次,CCNE1基因在G1/S過渡期間表達,編碼屬于高度保守的細胞周期蛋白家族。研究表明,晚期 SV40 因子(late SV40 factor 3, LSF)是從靜止進展到細胞周期所必需的一種轉錄因子,并在G(1)/S周期調節(jié)TYMS基因的表達,而LSF主要被CCNE家族磷酸化[16]。所以,CCNE1或CCNE家族的其他成員可能通過間接作用調節(jié)TYMS基因的表達來產(chǎn)生下游效應。最后,轉錄因子E2F控制TYMS的表達[17-18],存在于機體大多數(shù)細胞中,參與細胞周期進展、細胞增殖、分化和凋亡等生理過程。核轉錄因子E2F3是一種細胞周期關鍵蛋白,也是調控細胞有絲分裂的重要因子,調節(jié)細胞周期的進展[19],與多種致癌、抑癌基因密切相關。國內外多位學者對E2F3基因促進EOC進展的機制進行了研究。例如,Reimer等[20]的研究發(fā)現(xiàn),E2F3在EOC進展中受表皮生長因子影響,在腫瘤細胞增殖中起著關鍵作用。He等[21]的研究發(fā)現(xiàn)在 EOC 細胞周期中,E2F3與極光家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-A蛋白(Aurora family of serine/threonine protein kinases-A,Aurora-A)的啟動子結合,形成E2F3-Aurora-A軸,E2F3異位表達刺激啟動子活性,誘導Aurora-A表達增加,促進癌細胞G2/M細胞周期進展。

綜上所述,本研究利用生物信息技術在公共腫瘤數(shù)據(jù)庫中進行目標基因的分析,發(fā)現(xiàn)TYMS基因在EOC中表達顯著增高,并通過調節(jié)有絲分裂細胞G1/S期轉化、細胞周期、嘧啶代謝、DNA復制和堿基切除修復等通路,參與EOC的發(fā)生發(fā)展。其次,E2F3可能通過與TYMS結合調控其表達,調節(jié)細胞周期進展,促進EOC進展。本研究是一項初步研究,在未來需要進一步的體內和體外實驗來驗證TYMS的生物學功能,揭示TYMS在卵巢癌的發(fā)病機制,探索TYMS作為EOC診斷、預后預測及靶向治療的潛在生物標志物的研究價值。生物信息學作為一種新興的科學,對生物醫(yī)學的研究中尋找關鍵基因及潛在的治療靶點具有重要意義,省時、省力,并可減少盲目性。