彭翔飛 羅明興

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種由氣流受限導(dǎo)致呼吸困難的肺部疾病。COPD是一種可以預(yù)防和治療的慢性氣道疾病,通常與顯著暴露于香煙煙霧等有害毒顆粒或氣體有關(guān),有較高致殘率和死亡率[1]。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是一類蛋白酶,HDAC6主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,是唯一具有兩個串聯(lián)催化結(jié)構(gòu)域的HDAC亞型[2-3]。有研究表明,HDAC6是多種類型腫瘤[4]、神經(jīng)退行性疾病[5]、炎癥性疾病[6]等疾病的治療靶點(diǎn)?？乖鲋车鞍? (prohibitin 1,PHB1)是一種廣泛表達(dá)且高度保守的蛋白。PHB1可以參與細(xì)胞周期的整個過程,包括細(xì)胞周期的存活、凋亡[7]、分化[8]和衰老[9]。PHB1在癌癥[10]、炎癥[11]、自身免疫疾病[12]等中發(fā)揮作用。因此本研究檢測了COPD患者血清HDAC6和PHB1的水平,探討二者的表達(dá)與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系及臨床意義,為COPD患者的診斷提供理論臨床依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

收集2014年6月至2020年7月在本院住院的COPD患者156例,并根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013 年修訂版)》[13]的標(biāo)準(zhǔn),將COPD患者分為穩(wěn)定期(穩(wěn)定期COPD組)和急性加重期(AECOPD組)。其中穩(wěn)定期COPD組60例,男性38例,女性22例,平均年齡(64.23±4.12)歲;AECOPD組96例,男性56例,女性40例,平均年齡(63.28±4.89)歲。另選擇同期在本院體檢的健康者148例作為對照組。所有受試者或其家屬簽署知情同意書,本研究獲得本院倫理委員會審核、批準(zhǔn)后實(shí)施(20140016)。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)患者經(jīng)臨床病理確診,均符合COPD疾病癥狀[13];(2)心、肝、腎等重要臟器功能基本正常;(3)臨床資料齊全;(4) 所有受試者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)肺部以外的全身感染性疾病者;(2)合并自身免疫、腫瘤疾病者;(3)患有其他感染疾病或精神疾病者;(4)患有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者;(5)慢性腸道疾病、糖尿病合并嚴(yán)重并發(fā)癥患者。

二、研究方法

樣品采集:采集患者入院次日早晨空腹肘靜脈血5mL,穩(wěn)定期COPD組患者及對照組在隨診及體檢當(dāng)日,均于晨起空腹抽取肘靜脈血5mL。所有血液標(biāo)本于4℃低溫冷凍離心機(jī),3000 r/min離心20 min,收集上清液,放置-80℃冰箱中保存待測。

三、觀察指標(biāo)

血清HDAC6水平檢測:嚴(yán)格按照人HDAC6 ELISA檢測試劑盒(北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)說明書配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,采用酶標(biāo)儀測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm處的吸光度值,繪制HDAC6的標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線。于-80℃冰箱中取適量血清樣本,解凍,測定樣本在450 nm處的吸光度值,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線計算血清HDAC6的水平。

血清PHB1的相對表達(dá)量檢測:按照Trizol試劑(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)操作步驟分離提取組織總RNA,RNA的濃度和純度用紫外分光光度計測定(上海昂拉儀器有限公司),RNA總?cè)芤篈240/A280在1.8～2.1范圍內(nèi),總RNA的純度較高,表明沒有污染,可以用于后續(xù)試驗(yàn)。用1%變性瓊脂糖凝膠電泳分析提取總RNA的完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(新貝(上海)生物科技有限公司)操作步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行q-PCR。反應(yīng)體系共20 μL:cDNA(50 ng/μL)2 μL,SYBR Green Master Mix(2×)(北京伊塔生物科技有限公司)10 μL,PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至20 μL。目的基因PHB1與管家基因GAPHD均使用2-△△Ct函數(shù)值(Ct為循環(huán)閾值)進(jìn)行計算(見表1)。

表1 qRT-PCR引物序列

肺功能檢查:采用肺功能診斷儀檢測(南京貝登醫(yī)療股份有限公司),采用肺功能儀檢測用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、第1秒用力呼氣量占用力肺活量比值 (FEV1/ FVC)、呼氣峰值流量( peak expiratory flow,PEF)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料比較

如(表2)所示,穩(wěn)定期COPD組、AECOPD組在性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙指數(shù)方面與對照組均無顯著差異,說明三組資料具有可比性(P>0.05)。

表2 三組一般情況比較

二、3組受試者肺功能指標(biāo)比較

如(表3)所示,穩(wěn)定期COPD組、AECOPD組的FVC、FEV1/ FVC、PEF均顯著低于對照組,且AECOPD組的FVC、FEV1/ FVC、PEF低于穩(wěn)定期COPD組,差異具有統(tǒng)計意義(P<0.05)。

表3 三組受試者肺功能指標(biāo)比較

三、三組受試者HDAC6和PHB1水平比較

穩(wěn)定期COPD組、AECOPD組的HDAC6水平均顯著高于對照組(P<0.05),其中穩(wěn)定期COPD組HDAC6的表達(dá)水平較AECOPD組低,差異顯著(P<0.05)。穩(wěn)定期COPD組、AECOPD組的PHB1水平均顯著低于對照組,且AECOPD組PHB1的表達(dá)水平最低,差異具有統(tǒng)計意義(P<0.05)(見表4)。

表4 三組受試者HDAC6和PHB1水平比較

四、HDAC6和PHB1相對表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性

HDAC6表達(dá)水平與FVC、FEV1/ FVC、PEF均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P均<0.05),PHB1的表達(dá)水平與FVC、FEV1/ FVC、PEF呈正相關(guān)關(guān)系(P均<0.05)(見表5)。

表5 HDAC6和PHB1水平與肺功能指標(biāo)相關(guān)性分析

五、影響AECOPD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

以 COPD 患者是否為AECOPD為因變量(是=1,否=0),以(表2、4)中有差異的指標(biāo)HDAC6(實(shí)際值)、PHB1(實(shí)際值)為自變量進(jìn)行 Logistic 回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清HDAC6和PHB1為影響AECOPD發(fā)生的獨(dú)立危險因素(OR=3.307、3.635)(見表6)。

表6 影響AECOPD發(fā)生的多因素Logistic回歸分析

六、血清HDAC6和PHB1診斷AECOPD價值

ROC分析結(jié)果顯示,HDAC6、PHB1診斷AECOPD的截斷值分別為197.35 pg/mL、0.45,曲線下面積(AUC)分別為0.911、0.847,二者診斷AECOPD的靈敏度分別為85.40%、80.20%,特異度為88.30%、76.70%。二者聯(lián)合診斷的AUC為0.928,靈敏度和特異度為89.60%和91.70%,高于HDAC6、PHB1單獨(dú)診斷的AUC。其中二者聯(lián)合診斷優(yōu)于血清PHB1單獨(dú)診斷(Z二者聯(lián)合-PHB1=2.014,P=0.044),與HDAC6單獨(dú)診斷無差異(Z二者聯(lián)合-HDAC6=0.523,P=0.601)(見表7、圖1)。

表7 血清HDAC6、PHB1診斷AECOPD價值

圖1 血清HDAC6、PHB1診斷AECOPD的ROC曲線

討 論

COPD是一種異質(zhì)性的慢性呼吸道疾病,常見癥狀為慢性咳嗽、咳痰、氣短或呼吸困難、喘息和胸悶等,可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭。COPD的致殘率和病死率很高,常發(fā)生于中老年人中,COPD患者后期還會并發(fā)多種心血管疾病,更進(jìn)一步加速了患者的致殘率和死亡率,并可誘發(fā)慢性高碳酸血癥呼吸衰竭(CHRF)和肺癌等疾病[14-15],這些都給患者造成了巨大的健康負(fù)擔(dān),嚴(yán)重?fù)p害了患者的生活質(zhì)量、運(yùn)動能力和肺功能[16]。因此,尋找能夠反映COPD嚴(yán)重程度的特異性生物標(biāo)志物極為重要。

HDAC6是HDAC中的重要成員,是研究最為廣泛的IIb類HDAC。HDAC6基因位于Xp11.23中,負(fù)責(zé)編碼一種含有1215個氨基酸的蛋白質(zhì)。HDAC6中有兩個同源功能催化結(jié)構(gòu)域,它們具有獨(dú)立的功能[17]。位于HDAC6蛋白C端的泛素結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域(ZnF-UBP結(jié)構(gòu)域)在調(diào)節(jié)泛素化介導(dǎo)的降解中起著至關(guān)重要的作用[18]。HDAC6在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用,HDAC6的異常表達(dá)會引起癌癥、神經(jīng)退行性變等疾病。如HDAC6在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào),且與臨床病理特征密切相關(guān),是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的不良獨(dú)立危險因素[19]。PHB1是一種抗增殖蛋白家族蛋白,與PHB2在線粒體內(nèi)膜形成一個大的復(fù)合體。PHB1最初是從再生的大鼠肝臟中分離出來的,是一種抗增殖基因。PHB1位于染色體17q21區(qū),編碼一個30 kDa的蛋白質(zhì)。有研究表明,PHB1可以通過影響代謝過程在年齡相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用[20],PHB1具有腫瘤抑制基因的功能,位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)膜的PHB1在肝炎和肝硬化中具有抗氧化應(yīng)激和抗炎作用,可保護(hù)肝細(xì)胞免受炎癥因子和活性氧(reactive oxygen species, ROS)刺激造成的損傷。位于肝癌細(xì)胞核的PHB1低表達(dá)可抑制肝癌的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。

本研究檢測了156例COPD 患者(其中穩(wěn)定期COPD組60例,AECOPD組96例)及148例健康對照者血清中HDAC6、PHB1的水平,結(jié)果表明:COPD患者血清中HDAC6水平顯著高于對照組,且AECOPD組血清中HDAC6的表達(dá)水平顯著高于穩(wěn)定期COPD組;穩(wěn)定期COPD組和AECOPD組血清PHB1的水平顯著低于對照組,且AECOPD組的水平明顯低于穩(wěn)定期COPD組,差異顯著。由此可見,血清HDAC6、PHB1表達(dá)水平的高低和COPD的病情嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究檢測了對照組、穩(wěn)定期COPD組、AECOPD組肺功能指標(biāo)顯示,穩(wěn)定期COPD組和AECOPD組的FVC、FEV1/FVC以及PEF的預(yù)測值顯著低于對照組,AECOPD組低于穩(wěn)定期COPD組。說明COPD患者伴有換氣及肺通氣功能障礙,其中AECOPD組患者肺功能損傷更為明顯。通過分析HDAC6、PHB1水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性表明,HDAC6水平與FVC、FEV1/FVC、PEF呈負(fù)相關(guān),PHB1水平與FVC、FEV1/FVC、PEF呈正相關(guān),提示HDAC6、PHB1可能參與了 COPD 患者的疾病進(jìn)展。 Logistic回歸分析顯示,HDAC6、PHB1均為影響AECOPD發(fā)生的獨(dú)立危險因素(OR=3.307、3.635,P均<0.05);同時ROC分析結(jié)果表明HDAC6、PHB1檢測對AECOPD均具有較好的診斷價值,而二者聯(lián)合診斷價值更高,提示二者可以作為診斷COPD患者疾病程度的指標(biāo),對COPD的篩查和明確診斷提供客觀依據(jù)。

綜上所述,血清HDAC6在COPD患者中高表達(dá),血清PHB1在COPD患者中低表達(dá),HDAC6、PHB1表達(dá)水平的高低與 COPD 患者疾病嚴(yán)重程度及肺功能有關(guān),可用于病情評估,具有一定的臨床意義。然而HDAC6、PHB1參與COPD發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步加大樣本來探究。