朱鑫磊 江錫銘 黃臻輝

(上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司 200240)

多黏菌素B 是一種由多黏芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的堿性高分子多肽類抗生素，對革蘭陰性菌有強效殺菌作用，但因有腎毒性和神經(jīng)毒性，過去使用較少。隨著超級耐藥菌的出現(xiàn)，多黏菌素B 被再次啟用，作為治療泛革蘭陰性菌感染的最后選擇[1-3]。其組成較為復(fù)雜，包含多種單體[4-9]，文獻雖然提及相關(guān)分離純化工藝，但未涉及運用高效液相分離各主要單體的內(nèi)容。本文闡述運用高效液相色譜分離硫酸多黏菌素B 中各單體及其制備過程，為硫酸多黏菌素B 成分研究及臨床使用提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 儀器與主要試劑

1260 分析型高效液相色譜儀（Agilent 公司）；SD-1制備型高效液相色譜儀（Varian 公司）；FE20 pH 計（Mettler Toledo 公司）；真空冷凍干燥機（上海東富龍制藥設(shè)備制造有限公司）；SolariX 7.0T 型傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（Bruker 公司）。

硫酸多黏菌素B 原料藥（武漢匯海醫(yī)藥有限公司）、乙腈（星可高純?nèi)軇┯邢薰?，制備級）、磷酸（Fisher公司，HPLC 純）；水為本公司自制純化水。

1.2 高效液相色譜分析

參考中國藥典（2015 年版）硫酸多黏菌素B 項下的分析方法[4]，選擇Diamonsil Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬科技公司），以硫酸鈉溶液（4.46 g 無水硫酸鈉溶解在900 mL 水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.3 后用水定容至1 L）-乙腈（78 ∶22）為流動相，等度洗脫，流速為1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL，檢測波長215 nm。

1.3 硫酸多黏菌素B 成分分析

多黏菌素B 是微生物發(fā)酵產(chǎn)物，由一系列結(jié)構(gòu)類似的環(huán)脂肽化合物組成，其主要單體包括有效成分多黏菌素B1和B2、主要雜質(zhì)B3和Ile-B1、其他已知雜質(zhì)B6和Ile-B2及一些未知單體（圖1）。其中多黏菌素B1、B2、B3、Ile-B1、Ile-B2及B6的骨架結(jié)構(gòu)基本相同，僅在兩個取代基上有所不同（圖2，表1）。

表1 多黏菌素B各單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)區(qū)別

圖1 硫酸多黏菌素B各單體色譜圖

圖2 多黏菌素B的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1.4 各單體制備液相分離純化

1.4.1 初步分離

稱取3 g 硫酸多黏菌素B 原料藥，用純化水溶解，制備成質(zhì)量濃度為600 mg/mL 的溶液，通過制備液相進行初次制備分離。

Kromaisl 10-100 C18制備色譜柱[50 mm×250 mm，10 μm；安捷倫科技(中國)有限公司]；流速100 mL/min；檢測波長λ=215 nm，流動相A1：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.43），B：乙腈；按表2 進行初次洗脫。分管收集洗脫峰為B1、B2、B3、Ile-B1、Ile-B2與B6的初次分離產(chǎn)物溶液，HPLC 測定后，分別合并純度大于80%的收集液，待進一步純化。

表2 初次分離梯度洗脫

部分收集液濃度低，體積大，可采用先上柱富集再梯度洗脫（表3），經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去乙腈后，再上樣純化。體積小的部分通過加水稀釋，將乙腈濃度降至12%以下后直接上樣純化。

表3 富集梯度洗脫方法

1.4.2 多黏菌素B1

Kromaisl 10-100 C18制備色譜柱（50 mm×250 mm，10 μm；自裝）；流速100 mL/min；檢驗波長λ=215 nm，流動相A2：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用2.5 mol/L H2SO4調(diào)節(jié)pH 至2.92），B：乙腈；按表4 進行梯度洗脫。合并純度大于95%的收集液。

表4 B1梯度洗脫

1.4.3 多黏菌素Ile-B1與B3

Ile-B1與B3的初次收集液分別通過反相高效液相色譜進行二次純化，收集洗脫峰。層析條件同1.4.2，按表5 梯度洗脫，合并純度大于98%的收集液。

表5 Ile-B1與B3梯度洗脫

1.4.4 多黏菌素B2

B2收集液（純度約87.6%)，先經(jīng)制備柱進行富集，洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去乙腈后，采用Kromaisl 7-100 C18制備色譜柱（50 mm×250 mm，7 μm；自裝），流動相A3：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.5），按表5 梯度洗脫，合并純度大于98%的收集液。

1.4.5 多黏菌素Ile-B2

合并純度>95%的收集液，分多次上柱純化。采用UniPS 5-300 C18AQ 制備色譜柱（21.2 mm×250 mm，5 μm；納微科技公司），流速20 mL/min，流動相A4：0.03 mol/L Na2SO4（溶于水后用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.54），按表6 梯度洗脫，合并純度大于99%的收集液。

表6 Ile-B2梯度洗脫

1.4.6 多黏菌素B6分離純化

合并純度>95%的收集液，分多次進行純化。層析條件同1.4.5，按表7 梯度洗脫，合并純度大于97%的收集液。

表7 B6梯度洗脫

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)單體的檢測結(jié)果

各單體的收集液，經(jīng)減壓濃縮去除乙腈后，冷凍干燥，獲得6 個單體（表1）。通過ESI-MS 檢測，表明各單體的相對分子質(zhì)量的檢測值與理論值相符（表8），確認是目標(biāo)單體，經(jīng)HPLC 分析（圖3），純度均大于96%，可供相關(guān)質(zhì)量研究使用。

表8 各單體ESI-MS檢測

圖3 多黏菌素B各單體HPLC譜圖

2.2 初次純化條件的優(yōu)化

為提高工藝效率，在保證各單體分離度的條件下，須盡可能提高單次上樣量。當(dāng)單次上樣量達到3 g 時，已經(jīng)出現(xiàn)B2、B3單體難以分離的情況。故最初次制備分離的上樣量為每次3 g。

通過實驗對比，發(fā)現(xiàn)在相同的洗脫條件下，采用UniSil C18AQ（21.2 mm×250 mm，10 μm；納微科技公司）的制備柱和100 mg/mL 的硫酸多黏菌素B 上樣液，經(jīng)反相制備液相純化，以流動相A（磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.2）-B（78.5 ∶21.5）等度洗脫，單體Ile-B2與B6的分離效率較佳。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，相同洗脫條件下，降低流動相A 的pH 可使部分單體的出峰時間提前；精制時，適度調(diào)整其酸度能取得更好的純化效果。另外，使用磷酸調(diào)節(jié)流動相A 的pH 時，制備液相圖譜峰型優(yōu)于使用硫酸。Ile-B2和B6出峰時間相近，在實際操作中使用磷酸調(diào)節(jié)流動相A 的pH，其分離效果好于硫酸，能使兩者更好地分離。

本研究建立了一種通過反相液相色譜法直接從硫酸多黏菌素B 中分離出各高純度單體的方法，相比定向合成對應(yīng)的單體，省時、高效、經(jīng)濟，可重復(fù)性強，設(shè)備和材料需求低。所制備的樣品純度均大于96%，符合相關(guān)質(zhì)量研究的要求，能降低企業(yè)相關(guān)質(zhì)量研究的成本，為本公司開展產(chǎn)品“硫酸多黏菌素B”的相關(guān)臨床研究提供了技術(shù)支持。

致謝：上海交通大學(xué)分析測試中心桂娟老師幫助完成各單體的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。