毛文學(xué) 余音 李欣鈺 余丹丹

（上海研諾醫(yī)藥科技有限公司 上海 201114）

兩性霉素B（AmB）是一種多烯類廣譜抗真菌抗生素，是治療敏感深部真菌感染的首選藥物之一[1-3]，但AmB 的作用機(jī)制決定了其在破壞真菌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致人體正常細(xì)胞損傷，影響細(xì)胞膜的運(yùn)輸，長期使用還會(huì)造成腎損傷及循環(huán)系統(tǒng)的損傷，表現(xiàn)出蛋白尿、氮質(zhì)血癥、低血鉀、貧血等癥狀[4]。Kagan 等[5]在研究AmB制劑時(shí)以酵母細(xì)胞為模型，通過酵母的存活率和細(xì)胞內(nèi)K+濃度來評價(jià)AmB 制劑及AmB-阿拉伯半乳聚糖共軛物（AmB-arabinogalactan conjugate，AmB-AGC） 聯(lián)合用藥的毒性變化。Gruda 等[6]以紅細(xì)胞中K+的保留量為指標(biāo)，證明蔗糖單月桂酸酯能夠在不降低AmB 抑制真菌能力的同時(shí)消除其對紅細(xì)胞的毒性。de Araújo 等[7]的研究表明AmB 膠束對紅細(xì)胞的毒性與K+的泄漏呈濃度依賴性。

國內(nèi)外諸多圍繞AmB 劑型改良、聯(lián)合用藥及拓展應(yīng)用的研究都以其毒性為重要評價(jià)指標(biāo)[8-10]，利用AmB增加細(xì)胞膜通透性導(dǎo)致單價(jià)陽離子泄漏的特點(diǎn)，以泄漏的K+含量表征AmB 制劑毒性。在其他相關(guān)研究中，K+含量的測定多使用火焰光度計(jì)、原子吸收分光光度計(jì)、電解質(zhì)分析儀及生化分析儀等設(shè)備[7,11-12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度會(huì)受設(shè)備及樣本處理方法等因素的影響，如火焰光度計(jì)無法測出元素的絕對濃度值，而生化分析儀由于樣本處理中使用肝素抗凝劑，會(huì)影響靜脈血清K+測定，導(dǎo)致測得的K+含量偏高。本研究選擇紅細(xì)胞為載體，以HPLC 法對紅細(xì)胞滲漏的K+濃度進(jìn)行檢測，建立了一套針對AmB 制劑的毒性評價(jià)方法。此方法能夠準(zhǔn)確高效地評價(jià)工藝及處方對細(xì)胞毒性的影響，為AmB 制劑的研究應(yīng)用拓寬了道路。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

10%大鼠紅細(xì)胞（批號(hào)：BC20200809、BC20200813、BC20200818，南京生航生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：20200811、20200814、20200823，南京森貝伽生物科技有限公司）；AmB 原料藥[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]、AmB 脂質(zhì)體凍干制劑（自制）；其余化學(xué)制劑均為市售分析純。

1.2 儀器

E2695 高效液相色譜儀（Wasters 公司，帶檢測器2424 ELS Detector）；XS205 型分析天平（Mettler Toledo公司）；MX-RD-Pro 型旋轉(zhuǎn)混勻儀[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司]；GNP-9050 型恒溫箱（上海精其儀器有限公司）；TGL-16.5M 型離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 溶液配制

1）PBS 溶液 配制含147 mmol/L 氯化鈉、3 mmol/L氯化鉀、10 mmol/L 磷酸氫二鈉的PBS 溶液，以1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至7.4±0.1 保存?zhèn)溆肹9]。

2）陽性對照液 準(zhǔn)確稱取AmB 原料藥50 mg、脫氧膽酸鈉41 mg、磷酸鈉 20.2 mg，加入純化水10 mL溶解，得5 mg/mL AmB 脫氧膽酸鹽溶液，以PBS 稀釋至1 mg/mL。

3）供試品溶液 取AmB 脂質(zhì)體凍干制劑1 支（每支含AmB 50 mg），加入純化水10 mL 復(fù)溶，得約5 mg/mL AmB 脂質(zhì)體溶液，以PBS 分別稀釋至1 mg/mL、500 和250 μg/mL。

4）陰性對照液 PBS 溶液。

1.4 紅細(xì)胞預(yù)處理及樣品孵化

1）紅細(xì)胞洗滌濃縮 取市售10%大鼠紅細(xì)胞45 mL，用PBS 溶液離心洗滌（500 g，10 min，4 ℃）4 次至上清澄清后加入PBS 溶液分散并定容至10 mL，得45%大鼠紅細(xì)胞懸液。

2）紅細(xì)胞孵化 取45%大鼠紅細(xì)胞450 μL 于1.5 mL 離心管內(nèi)，分別加入陽性對照、供試品或陰性對照50 μL，混勻。將離心管固定于旋轉(zhuǎn)混勻儀上，于37 ℃恒溫箱內(nèi)以12 r/min 水平旋轉(zhuǎn)孵化。于取樣時(shí)間點(diǎn)取出樣品，離心（1 000 g，10 min，4 ℃）后取200 μL 上清液于液相進(jìn)樣小瓶中，加超純水800 μL，混勻得稀釋5倍的供試品溶液，按HPLC 條件進(jìn)行分析。

1.5 HPLC 鉀離子含量檢測色譜條件

采用Waters XBridge Hilic 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1 mol/L 乙酸銨- 乙腈=15 ∶85；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；載氣206.84 kPa；漂移管溫度80 ℃；運(yùn)行時(shí)間20 min。

2 結(jié)果

2.1 K+釋放與紅細(xì)胞孵育時(shí)間關(guān)系考察

陰性對照的K+釋放濃度未隨孵育時(shí)間而增加，表明本研究采用的孵化條件對大鼠紅細(xì)胞細(xì)胞膜通透性無顯著影響，不會(huì)造成K+額外滲漏。作為陽性對照的1 mg/mL AmB 脫氧膽酸鹽溶液于孵育后0.5 h 內(nèi)快速釋放K+并于1 h 時(shí)達(dá)平臺(tái)濃度。相較于陽性對照，不同濃度的AmB 脂質(zhì)體對大鼠紅細(xì)胞的急性毒性顯著減小，且K+釋放呈時(shí)間與濃度依賴性，并于4 h 時(shí)達(dá)到最大K+釋放濃度（圖1）。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，后續(xù)研究中將4 h 作為考察AmB 制劑細(xì)胞毒性的孵育時(shí)間。

圖1 孵育時(shí)間對大鼠紅細(xì)胞K+釋放的影響

2.2 大鼠紅細(xì)胞K+釋放重復(fù)性考察

為考察方法重復(fù)性，分別使用了陽性對照液、不同濃度AmB 脂質(zhì)體溶液及陰性對照液按前述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并檢測紅細(xì)胞K+釋放濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過4 h 孵育，陽性對照組紅細(xì)胞K+釋放濃度最高，AmB 脂質(zhì)體引起的紅細(xì)胞K+釋放濃度隨AmB 濃度的降低而降低，表明大鼠紅細(xì)胞K+釋放濃度與供試品溶液中AmB濃度正相關(guān)（表1）。同組平行孵育的4 管樣品除AmB脂質(zhì)體250 μg/mL 組RSD 大于5%外，其余各組RSD均小于4%（表1），樣品組內(nèi)平行性好，證明本方法重復(fù)性良好，能夠滿足考察AmB 及其制劑細(xì)胞毒性評價(jià)的要求。

表1 孵育4 h后不同濃度AmB脂質(zhì)體溶液對K+釋放的影響（n=4）

2.3 大鼠紅細(xì)胞K+釋放批間差異考察

為研究大鼠紅細(xì)胞質(zhì)量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾程度，我們分別對兩個(gè)公司各3 批市售10%大鼠紅細(xì)胞進(jìn)行了對比研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，購自南京生航的3 批大鼠紅細(xì)胞在分別給予陽性對照液和陰性對照液4 h 后K+釋放濃度穩(wěn)定，批間差異小，僅1 mg/mL AmB 脂質(zhì)體溶液孵育的紅細(xì)胞樣品表現(xiàn)出了較大批間差異（表2）；南京森貝伽3 批大鼠紅細(xì)胞K+釋放濃度均表現(xiàn)出較大批間差異，其中批次3 的AmB 脂質(zhì)體溶液組K+釋放濃度顯著高于同組其余2 批紅細(xì)胞且高于陽性對照組，導(dǎo)致批間RSD達(dá)26.69%；同時(shí)，批次3 陽性對照組K+釋放濃度低于同組另2 個(gè)批次（表3）。綜合對比南京森貝伽各組別實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示批次3 大鼠紅細(xì)胞質(zhì)量可能是導(dǎo)致出現(xiàn)不符合不同AmB 制劑間細(xì)胞毒性規(guī)律結(jié)果的原因。

表2 南京生航3批次大鼠紅細(xì)胞孵化4 h后K+釋放濃度

表3 南京森貝伽3批次大鼠紅細(xì)胞孵化4 h后K+釋放濃度

2.4 紅細(xì)胞儲(chǔ)存時(shí)間與細(xì)胞毒性變化考察

對于細(xì)胞水平的體外毒性研究而言，除了細(xì)胞來源與批次之間的差異，細(xì)胞在儲(chǔ)存過程中的變化對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性也會(huì)產(chǎn)生一定影響。因此，對同一廠商的3 批大鼠紅細(xì)胞分別在入庫當(dāng)日于2 ～8 ℃保存7 d 后，與AmB 脫氧膽酸鹽溶液（1 mg/mL）孵育進(jìn)行對比。3批次紅細(xì)胞在入庫當(dāng)日（0 day）K+釋放濃度無顯著差異，保存7 d 后3 批次紅細(xì)胞K+釋放量均有不同程度的下降（圖2）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，部分紅細(xì)胞在儲(chǔ)存過程中失活皺縮，且市售紅細(xì)胞的保存液不能完全阻止其緩慢釋放K+，致使部分K+在洗滌濃縮過程中被去除，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞內(nèi)K+濃度隨儲(chǔ)存時(shí)間延長而下降。這可能是保存7 d 后大鼠紅細(xì)胞K+釋放濃 度整體降低的原因。

圖2 大鼠紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前保存時(shí)間對K+釋放的影響

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的方法可以精確測定出不同劑型、不同濃度、不同孵育時(shí)間紅細(xì)胞釋放的K+含量，并且不受其他雜質(zhì)離子的干擾。相較于使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型的毒性半數(shù)致死劑量實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的MTT 法、細(xì)胞毒性克隆實(shí)驗(yàn)等傳統(tǒng)毒性評價(jià)手段[13]，本方法不需要流式細(xì)胞儀和熒光標(biāo)記物等特殊儀器設(shè)備及耗材，具有成本低、周期短、易操作、對實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求低等特點(diǎn)。同時(shí)，紅細(xì)胞作為血液中占比高達(dá)40%～45%的細(xì)胞，來源廣泛，易于獲??；其具有完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞內(nèi)含有高濃度的K+，結(jié)合HPLC 檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確度高，更適合作為制劑處方、工藝變更的快速安全評價(jià)方法。

值得注意的是，細(xì)胞作為一種活體評價(jià)載體，會(huì)因種屬來源、采集方式、儲(chǔ)存及運(yùn)輸?shù)炔煌蛩囟斐杉?xì)胞生理活性上的差異。因此，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中適當(dāng)增加空白樣、平行樣或?qū)φ諛?。還應(yīng)嚴(yán)格控制紅細(xì)胞從采集到使用的各中間環(huán)節(jié)，包括避免長時(shí)間遠(yuǎn)距離運(yùn)輸、將紅細(xì)胞于2 ～8 ℃低溫保存但不可凍融、運(yùn)輸及使用過程中避免劇烈震蕩引發(fā)的溶血、保持無菌狀態(tài)并在開封后盡快使用完畢等注意事項(xiàng)。如有條件，宜從可靠的動(dòng)物中心采購固定種屬的大鼠或采用固定來源的現(xiàn)制紅細(xì)胞，即于實(shí)驗(yàn)當(dāng)日在無菌條件下采血提取紅細(xì)胞進(jìn)行藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，以消除種屬間差異及運(yùn)輸儲(chǔ)存條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

綜上所述，本方法不僅可以用于AmB 原料藥和脂質(zhì)體注射劑細(xì)胞毒性的快速測定，根據(jù)其實(shí)驗(yàn)原理還能應(yīng)用于其他AmB 劑型和能夠?qū)е翶+泄漏的藥物及其制劑的研究中，是一種具有良好前景的藥物細(xì)胞毒性評價(jià)方法。