葉鵬程, 楊鈞淞, 唐 錦, 譚 淼, 吳東津, 魏壽江

川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 胃腸外一科,四川 南充 637000

在世界癌癥發(fā)病率與病死率排名中,直腸癌分別位于第3位與第4位[1]。每年有超過100萬的直腸癌新病例,約70萬患者死于直腸癌[2]。直腸癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種因素,包括癌基因的激活與抑癌基因的失活[3]。腫瘤抑制基因的突變對于非侵襲性疾病向侵襲性疾病的轉(zhuǎn)變至關(guān)重要。侵襲性直腸癌中的突變頻率與惡性腫瘤程度相關(guān)[4-5]。長非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)是一類長度>200 bp的RNA,沒有編碼蛋白質(zhì)的能力[6]。與microRNA及其他小的非編碼RNA不同,LncRNA可以通過轉(zhuǎn)錄和翻譯來調(diào)控下游的目標基因[7]。LncRNA HOXD-As2位于2號染色體上,為homeobox D基因的反義鏈[8]。本研究旨在探討LncRNA HOXD-As2通路抑制直腸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移的潛在機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設(shè)備 直腸癌細胞HCT116購自廣州群賢科技有限公司(貨號:CH1101)。HT29細胞購自廣州悅行生物科技有限公司(貨號:T1028)。Trizol試劑購自上海玻爾化學試劑有限公司(貨號:B645504)。HOXD8抗體購自廣州市魯誠生物科技有限公司。上皮性鈣粘蛋白(E-Cadherin)抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司(貨號:WLH4321)。神經(jīng)性鈣粘蛋白(N-Cadherin)抗體購自廣州碩恒生物科技有限公司(貨號:sc-59987)?；|(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9,MMP-9)抗體購自廣州文奇生物科技有限公司(貨號:ab38898)。蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)抗體購自昆明皇寶商貿(mào)有限公司(貨號:AA326)。雷帕霉素機械靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)抗體購自北京依珊匯通科技有限公司(貨號:mTOR001)。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)抗體購自北京沃格東方科技有限公司(貨號:PI3K001)。磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)抗體購自廣州永諾生物科技有限公司(貨號:YNKT099)。磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)抗體購自北京伊諾凱科技有限公司(貨號:05-1003)。磷酸化雷帕霉素機械靶蛋白(phosphorylated mechanistic target of rapamycin,p-mTOR)抗體購自廣州沃亙生物科技有限公司(貨號:OGCP-04-54)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 直腸癌細胞HCT116或HT29在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),加入10%胎牛血清,37℃培養(yǎng)箱。檢測前2 d,將HOXD8與LncRNA HOXD-As2過表達質(zhì)粒通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至HCT116或HT29細胞中。其中,轉(zhuǎn)染陰性設(shè)為對照組,轉(zhuǎn)染LncRNA HOXD-As2過表達質(zhì)粒設(shè)為HOXD-As2組;轉(zhuǎn)染空載體Vector設(shè)為Vector組,轉(zhuǎn)染HOXD8過表達質(zhì)粒設(shè)為HOXD8組。

1.2.2 RNA抽取與實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng) 采用Trizol試劑從直腸癌細胞HCT116或HT29中分離RNA,用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成cDNA。采用Power SYBR Green PCR Master Mix檢測HOXD8的mRNA表達,以GAPDH作為內(nèi)源對照。

1.2.3 熒光素酶報告實驗 含有HOXA-AS2推定靶點的HOXD8野生體(HOXD8-WT)序列片段被合成并插入pmirGLO載體中。使用QuikChange Ⅱ位點定向誘變試劑盒產(chǎn)生HOXD8突變體(HOXD8-MT),突變位點為HOXA-AS2的結(jié)合位點。將含有HOXD8-WT的載體、HOXD8-MT的載體、HOXA-AS2過表達載體以及對照載體轉(zhuǎn)染至直腸癌細胞HCT116或HT29。轉(zhuǎn)染后48 h,使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測Renilla熒光素酶和螢火蟲熒光素酶的活性。相對熒光素酶的活性被標準化為Renilla熒光素酶的活性。

1.2.4 細胞活力與細胞增殖水平檢測 處理過的直腸癌細胞HCT116或HT29置于96孔板中24、48、72或96 h,采用0.5 mg/ml四氮唑鹽溶液培養(yǎng)3 h,然后用0.01 mmol/L氯化氫緩沖液后用細胞組織快速裂解液裂解細胞,用酶標儀測量450 nm處吸光度。將有指定轉(zhuǎn)染的直腸癌細胞HCT116或HT29置于6孔板中,每3 d更換1次培養(yǎng)基。2周后,采用0.4%結(jié)晶紫對甲醛固定的細胞進行染色,然后在光學顯微鏡下進行計數(shù)。

1.2.5 細胞侵襲和細胞遷移水平的檢測 將指定轉(zhuǎn)染的直腸癌細胞HCT116或HT29置于6孔板中,并通過吸管劃傷。24 h后,清除碎片,在顯微鏡下拍攝傷口寬度,并通過Image J軟件計算。在涂有Matrigel的Transwell試驗室的上腔填充100 μl無胎牛血清DMEM中的直腸癌細胞HCT116或HT29懸浮液。將含有15%胎牛血清的DMEM(600 μl)放入下腔。48 h后,用0.1%水晶紫對下腔室中的甲醛固定細胞進行染色,并在顯微鏡下進行計數(shù)。

1.2.6 免疫印跡 直腸癌細胞HCT116或HT29在細胞組織快速裂解液裂解和提取緩沖液中進行裂解。酸性蛋白試劑盒被用來測定細胞裂解液中的蛋白濃度。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞裂解液,然后將蛋白質(zhì)樣品電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。采用5%牛血清白蛋白溶液阻斷膜,然后采用一級抗體過夜。采用相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)孵育后,用增強化學發(fā)光法檢測膜上條帶的免疫活性。通過Image J軟件以β-actin為內(nèi)參計算條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 對照組與HOXD-As2組熒光素酶活性及相應(yīng)的mRNA、蛋白表達比較 與對照組相比,HOXD-As2組熒光素酶活性下降,而mRNA、蛋白相對表達情況增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 對照組與HOXD-As2組熒光素酶活性及mRNA、蛋白相對表達情況比較

2.2 LncRNA HOXD-As2對直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移影響 與對照組相比,HOXD-As2組直腸癌細胞HCT116、HT29細胞活力、細胞增殖、細胞侵襲、細胞遷移水平及N-cadherin、MMP-9蛋白表達均下降,E-cadherin蛋白表達增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 LncRNA HOXD-As2對直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移影響(a.不同時間點HCT116與HT29細胞活力水平;b.LncRNA HOXD-As2對細胞增殖水平影響;c.LncRNA HOXD-As2對細胞侵襲水平影響;d.LncRNA HOXD-As2對細胞遷移水平影響;e.LncRNA HOXD-As2對細胞E-cadherin、N-cadherin與MMP-9蛋白相對表達情況影響)

2.3 LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移影響 與對照組相比,HOXD-As2組直腸癌細胞HCT116、HT29中HOXD8的mRNA與蛋白表達水平均顯著上升,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與Vector組相比,HOXD8組直腸癌細胞HCT116、HT29細胞活力、細胞增殖、細胞侵襲、細胞遷移水平及N-cadherin、MMP-9蛋白表達均顯著下降,E-cadherin蛋白表達增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移影響(a.不同時間點LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對細胞活力水平;b.LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對細胞增殖水平;c.LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對細胞侵襲水平;d.LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對細胞遷移水平;e.LncRNA HOXD-As2靶向HOXD8對細胞E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白相對表達情況)

2.4 LncRNA HOXD-As 對直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移機制影響 HOXD-As2組直腸癌細胞HCT116、HT29中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR水平均低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HOXD8組直腸癌細胞HCT116、HT29中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR水平均低于Vector組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 LncRNA HOXD-As對直腸癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移機制影響(a.過表達LncRNA HOXD-As2對 細胞p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR相對表達水平影響;b.過表達HOXD8對細胞p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR相對表達水平影響)

3 討論

腫瘤作為一種多基因疾病,其主要機制為細胞逃避正常的生長控制進行自主增殖;同時,通過原癌基因的激活或腫瘤抑制基因的突變或缺失而表現(xiàn)出一定的侵襲性[9]。癌癥的發(fā)生存在許多調(diào)節(jié)因素,這些調(diào)節(jié)因子可以控制癌基因或抑癌基因的表達,發(fā)揮促進或抑制腫瘤發(fā)展作用。LncRNA作為一類沒有編碼蛋白質(zhì)的能力的RNA,其在人體中可以通過調(diào)控各種細胞因子、促凋亡和抗凋亡基因等信號分子的表達,控制細胞的增殖、分化和凋亡。LncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[10]。HOXD-AS2作為Homeobox D基因的反義鏈,主要定位于人染色體2q31.1,長度為692 bp。有研究報道,LncRNA HOXD-AS2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達,并與神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級和預(yù)后不良[11]。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn),LncRNA HOXD-AS1可以通過抑制HOXD3誘導(dǎo)的整聯(lián)蛋白β3轉(zhuǎn)錄激活和MAPK/AKT信號通路來調(diào)控大腸癌的生長和轉(zhuǎn)移,但具體機制并不清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,HOXD-As2組直腸癌細胞HCT116、HT29細胞活力、細胞增殖、細胞侵襲、細胞遷移水平及N-cadherin、MMP-9蛋白表達均下降,E-cadherin蛋白表達增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這提示,LncRNA HOXD-As2可能通過調(diào)控E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白表達參與直腸癌細胞增殖、侵襲及遷移。有研究報道,LncRNA HOXD-AS2的表達下降通過靶向HOXD8促進胃癌進展[13]。在膠質(zhì)瘤中,LncRNA HOXD-AS2的下調(diào)通過抑制腫瘤細胞的增殖及遷移改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[14]。Homeobox基因作為發(fā)育調(diào)節(jié)基因,在胚胎發(fā)育過程中給予細胞位置信息[15]。有研究報道,HOX基因參與肺癌、乳腺癌、口腔癌、食道癌以及黑色素瘤腫瘤的發(fā)展[16-17]。在直腸癌中,與原發(fā)組織相比,HOXD8的表達在臨床癌癥組織中特別是在轉(zhuǎn)移灶中被下調(diào)[18]。本研究結(jié)果顯示,與Vector組相比,HOXD8組直腸癌細胞HCT116、HT29的細胞活力、細胞增殖、細胞侵襲、細胞遷移水平及N-cadherin、MMP-9蛋白表達均顯著下降,E-cadherin蛋白表達增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這提示,LncRNA HOXD-As2可能通過與靶基因HOXD8相互作用,抑制PI3K/Akt通路影響直腸癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。這可能是由于PI3K/AKT信號通路作為人體中調(diào)控腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的一個關(guān)鍵通路,激活PI3K/AKT信號通路可明顯的抑制腫瘤細胞的凋亡[19-20]。

綜上所述,LncRNA HOXD-As2通過與靶基因HOXD8相互作用,上調(diào)HOXD8的mRNA與蛋白表達水平,抑制PI3K/Akt通路,降低直腸癌細胞增殖與轉(zhuǎn)移水平。