朱玉平 孫文陽名 羅金玉 何猛 任微 簡乾洪 陸冬玲 王大壽

自 2002 年臭氧引入國內(nèi)以后，臭氧在疼痛治療方面的運用越來越廣泛。臭氧使用的安全濃度范圍、療效、毒性反應(yīng)等方面在科研和臨床治療過程中曾有不同程度的分歧。經(jīng)過多年的動物實驗和臨床研究，臭氧的運用逐步規(guī)范。2021 年 Zhuang 等[1]發(fā)表了中國臭氧的專家共識，進(jìn)一步為規(guī)范臭氧的運用奠定了基礎(chǔ)。近些年來發(fā)現(xiàn)，臭氧溶于水具有比臭氧氣體更加安全可靠、有效且濃度可控等優(yōu)點，于是，臭氧水的研究和應(yīng)用也逐漸增多。臭氧水的應(yīng)用依然參考臭氧，但臭氧水的性質(zhì)畢竟有別于臭氧。目前針對臭氧水的動物實驗研究也相對較少，缺乏其不良反應(yīng)的研究，尤其是膝關(guān)節(jié)軟骨損傷方面。本文擬通過臭氧化生理鹽水模擬臭氧水的應(yīng)用，研究不同濃度臭氧化生理鹽水對家兔正常膝關(guān)節(jié)軟骨的影響，以進(jìn)一步探索臭氧水使用的安全性問題。

材料與方法

一、實驗儀器、材料及動物分組

臭氧發(fā)生儀 (OZEN2000 型，赫爾曼公司，德國)、剃毛刀、棉簽若干、碘酒、生理鹽水若干瓶、皮試注射器 (黔天使 1 ml) 若干。新西蘭家兔 20 只，購于貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心 [ 動物許可證編號：SYXK (貴) 2018·0050 ]，體重 (2.61±0.13) kg，均為雄性。采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取分組，結(jié)合文獻(xiàn)報道[1-2]，膝關(guān)節(jié)臭氧注射濃度一般為 30 μg / ml，也有文獻(xiàn)報道 33 μg / ml 的臭氧水濃度作用于膝關(guān)節(jié)未見不良反應(yīng)發(fā)生，故本研究設(shè)置臭氧化生理鹽水起始濃度為 30 μg / ml，濃度每組遞增 5 μg / ml，以觀察是否增加軟骨損傷風(fēng)險和加重?fù)p傷的程度。按臭氧化生理鹽水濃度的不同分為 4 組，即：Ⅰ組(30 μg / ml)，Ⅱ組 (35 μg / ml)，Ⅲ組(40 μg / ml)，Ⅳ組(45 μg / ml)。

二、臭氧化生理鹽水的制備

本實驗臭氧化生理鹽水的制備參照趙銘等[3]在臭氧化生理鹽水對神經(jīng)病理性疼痛影響研究中的制作方法。即由醫(yī)用臭氧發(fā)生儀制備臭氧，臭氧濃度分別設(shè)定為：30 μg / ml、35 μg / ml、40 μg / ml、45 μg / ml，將臭氧分別注入 100 ml 生理鹽水中，注入時間為 10 min，注入完畢后封裝冰袋低溫保存。

三、實驗方法

所有的實驗動物在安靜環(huán)境下分籠喂養(yǎng)，保障充足的飼料和飲用水，定期消毒動物房和食物盤，及時清理糞便。實驗前運用剃毛刀剔除家兔左膝關(guān)節(jié)周圍腿毛，常規(guī)運用碘酒消毒家兔膝關(guān)節(jié)周圍皮膚。臭氧水制備完畢后立即使用皮試注射器分別將相應(yīng)濃度 (30 μg / ml、35 μg / ml、40 μg / ml、45 μg / ml) 的臭氧化生理鹽水注射至家兔左膝關(guān)節(jié)內(nèi)，劑量為 1 ml。間隔 7 天后再次以同樣的方法向每只家兔同一膝關(guān)節(jié)腔注射相應(yīng)濃度的臭氧化生理鹽水。第二次臭氧化生理鹽水注射后第 7 天進(jìn)行病理活檢取材。

四、取材與標(biāo)本處理

予以丙泊酚 2 mg / kg 經(jīng)耳緣靜脈誘導(dǎo)麻醉，待家兔喪失意識后同時向耳緣靜脈內(nèi)注射 20 ml 空氣處死。常規(guī)消毒家兔膝關(guān)節(jié)周圍皮膚，在左膝關(guān)節(jié)前方縱向切開皮膚、皮下組織，剝離肌肉組織，充分顯示股骨下段、膝關(guān)節(jié)、脛骨上段，分別在膝關(guān)節(jié)上下 1 cm 處用咬骨鉗咬斷家兔股骨、脛骨，立即將所標(biāo)本分別放入甲醛溶液中固定，并在標(biāo)本盒外做好標(biāo)記。取材后常規(guī)包埋、切片、HE 染色等處理。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 16.0 進(jìn)行等級資料相關(guān)關(guān)系分析，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般結(jié)果

在第二次實驗之后，Ⅲ組(40 μg / ml)、Ⅳ 組(45 μg / ml) 各 1 只家兔不明原因死亡，剔除實驗組。最終共取材 18 份標(biāo)本，Ⅰ組5 份，Ⅱ 組5 份，Ⅲ組4 份，Ⅳ組4 份。

二、病理結(jié)果

本研究采用日本奧林巴斯顯微鏡觀察家兔軟骨病理變化，其結(jié)果具體如下：Ⅰ組3 份 (60%) 標(biāo)本正常，2 份標(biāo)本出現(xiàn)軟骨細(xì)胞減少，軟骨關(guān)節(jié)面見局灶性裂隙；Ⅱ 組軟骨細(xì)胞減少，軟骨關(guān)節(jié)面見局灶性裂隙 1 份，單純軟骨局灶性裂隙 2 份，軟骨細(xì)胞減少，少數(shù)區(qū)域軟骨基質(zhì)并粱性減弱 1 份，軟骨表面見局灶性裂隙并糜爛 1 份；Ⅲ 組軟骨細(xì)胞減少，軟骨基質(zhì)并粱性減弱，表面見裂隙及糜爛 1 份，軟骨基質(zhì)并粱性減弱，表面見裂隙及糜爛2 份，軟骨細(xì)胞減少，軟骨表面裂隙及糜爛 1 份；Ⅳ 組軟骨細(xì)胞減少，軟骨基質(zhì)并粱性減弱，表面見裂隙及糜爛 2 份，軟骨細(xì)胞減少，軟骨表面見裂隙 1 份，軟骨基質(zhì)并粱性減弱，表面見裂隙及糜爛1 份。Ⅱ 組、Ⅲ 組、Ⅳ 組均有不同程度的軟骨病理損傷，發(fā)生率均為 100%。按照不同病理結(jié)果分成 5 類，即：正常、軟骨細(xì)胞減少、關(guān)節(jié)面裂隙、軟骨面糜爛、軟骨基質(zhì)并梁性減弱，其統(tǒng)計結(jié)果見表1，標(biāo)本典型的病理改變見圖1。

表1 不同濃度臭氧化生理鹽水所對應(yīng)病理改變類型Tab.1 Types of pathological changes corresponding to different concentrations of ozonated saline

圖1 不同濃度的臭氧化生理鹽水導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨的病理改變 (HE 染色×200)a：Ⅰ組(30 μg / ml)：關(guān)節(jié)軟骨正常；b：Ⅰ組 (30 μg / ml)：軟骨細(xì)胞減少，表面局灶見裂隙；c：Ⅱ組 (35 μg / ml)：軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，少數(shù)區(qū)域基質(zhì)并梁性減弱，局灶表面見裂隙；d：Ⅲ 組(40μg / ml)：軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，基質(zhì)并梁性減弱，表面見裂隙及糜爛；e：Ⅳ組 (45 μg/ ml)：軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，基質(zhì)并梁性減弱，表面見裂隙及糜爛Fig.1 Different ozonated saline concentrations cause pathological alterations in knee cartilage (HE staining × 200) a: Group Ⅰ (30 μg / ml),the typical articular cartilage; b: Group Ⅰ (30 μg / ml), chondrocyte shrinkage accompanied with surface fissures; c: Group Ⅱ (35 μg / ml), fewer chondrocytes, weaker matrix amalgamation of some sections, and fissures on the focal surface; d: Group Ⅲ (40 μg / ml), fewer chondrocytes,weaker matrix amalgamation, fissures and erosions on the surface; e: Group Ⅳ (45 μg / ml), drastically reduced chondrocyte quantity, weaker matrix amalgamation, fissures and erosions on the surface

三、軟骨組織病理分級結(jié)果

借鑒骨關(guān)節(jié)炎研究國際學(xué)會 (Osteoarthritis Research Society International，OARSI) 骨關(guān)節(jié)炎病理評價系統(tǒng)中的軟骨組織病理分級標(biāo)準(zhǔn)對本研究關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行病理分級[4]。0 級：表面軟骨灶，軟骨形成正常；1 級：表面完整；2 級：表面不連續(xù)；3 級：垂直裂隙；4 級：侵蝕；5 級：剝蝕；6 級：畸形。本研究最高病理分級為 3 級，具體結(jié)果為：Ⅰ 組0級3例，1級2例；Ⅱ組1級3例，2級1例，3級1例；Ⅲ組3級4例；Ⅳ組2級1例，3 級3例 (表2)。

表2 不同臭氧化生理鹽水濃度所導(dǎo)致的軟骨組織病理分級Tab.2 Pathological grading of cartilage tissue caused by different ozonated saline concentrations

四、統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

為了解臭氧化生理鹽水濃度與家兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷之間是否存在關(guān)聯(lián)，將不同病理分級所對應(yīng)的臭氧化生理鹽水濃度進(jìn)行等級資料的 Spearman 相關(guān)關(guān)系分析，定義 X 為臭氧化生理鹽水濃度，Y 為軟骨損傷的不同病理分級，經(jīng) SPSS 計算得出：r=0.515，P= 0.002，結(jié)果的差異性有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) 。

討 論

臭氧又稱為三氧 (O3) 或富氧，是一種無色、帶有特殊刺激性氣味的高性能活性物質(zhì)，在常規(guī)氣溫、氣壓下化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易分解氧氣，在水中溶解度較好，是氧氣的 10 倍[1,5]。臭氧溶于水后形成臭氧水，常溫下克服了臭氧易揮發(fā)的特點，具有良好的生物兼容性和安全性[6-8]。本研究的臭氧化生理鹽水本質(zhì)仍然屬于臭氧水。臭氧水除了含有 O3，還能產(chǎn)生大量單原子氧 (O-)、羥基 (OH-)、過氧化氫 (H2O2) 等新產(chǎn)物，可迅速分解有機(jī)物、細(xì)菌及其它微生物[2,9-11]?？梢?，臭氧水除了兼?zhèn)涑粞醯淖饔锰攸c外，還兼?zhèn)?O-、OH-、H2O2等物質(zhì)的氧化屬性，臭氧水的濃度越高，作用效果越高[6,12]。臭氧水具有殺菌、抗炎、止痛、促進(jìn)組織修復(fù)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死等作用，當(dāng)前臭氧水的研究和應(yīng)用主要集中于關(guān)節(jié)注射、口腔和婦科疾病、創(chuàng)面感染、抗腫瘤、消毒等方面[2,9,13-16]。然而，使用過高濃度的 O3可能產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，如：O3對呼吸道有明顯的毒性反應(yīng) (刺激性咳嗽、呼吸困難、肺水腫等)，O3局部注射可能會產(chǎn)生短暫的疼痛、發(fā)熱，嚴(yán)重者引起日常生活行為受限、致殘，甚至危及生命。皮膚接觸臭氧水可能出現(xiàn)脫屑、干燥、灼燒感、色素沉著等，但如今沒有一份專家共識或指南提出臭氧水其它應(yīng)用方式 (如關(guān)節(jié)注射、局部軟組織注射等) 的安全性問題[8-9,17]。高濃度的臭氧水是否存在類似臭氧隨濃度升高而不良反應(yīng)加重的現(xiàn)象，本研究通過觀察臭氧水作用于正常家兔軟骨后的病理改變進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果顯示，30 μg / ml 的臭氧化生理化鹽水可能造成輕微家兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。韓文彪等[17]報道臭氧水使用的一般濃度為 10～20 μg / ml。牟建蛟等[13]和王碧穎[14]報道，臨床上使用濃度為 23 μg / ml臭氧水注射膝關(guān)節(jié)，未見明顯副作用的發(fā)生。而膝關(guān)節(jié)臭氧注射的安全濃度一般 ≤ 30 μg / ml[1]。本研究使用濃度為 30 μg / ml 的臭氧化生理化鹽水高于上述作者[13-14,17]的報道，雖 Ⅰ組(30 μg / ml) 中有 3 份標(biāo)本病理正常，但出現(xiàn)了 2 份輕度軟骨損傷。推測 Ⅰ組(30 μg / ml) 出現(xiàn)病理損傷的可能原因如下[2,5,9,11,18-19]：(1) 由臭氧水本身性質(zhì)決定，臭氧水半衰期相對于臭氧縮短，臭氧很快在水中被釋放、分解，產(chǎn)生更多的強(qiáng)氧化性物質(zhì)影響軟骨細(xì)胞 DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的代謝，進(jìn)而引起軟骨細(xì)胞損傷，臭氧化生理鹽水的作用強(qiáng)于臭氧；(2) 臭氧化生理鹽水可能改變了關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液的酸堿平衡和滲透壓，超過關(guān)節(jié)腔的適應(yīng)能力造成軟骨細(xì)胞損傷；(3) Ku?ka 等[19]動物實驗研究指出，隨著臭氧水濃度升高和延長作用時間，臭氧水的破壞力增強(qiáng)。對比周天睿[2]的報道 (臭氧水濃度低于33 μg / ml，作用時間 ＜ 1 h，一般不會產(chǎn)生不良反應(yīng))。本實驗臭氧化生理鹽水雖濃度低于 33 μg / ml，但其作用時間長、頻次多 (7 天 1 次，共 2 次)。綜合研究和本研究的結(jié)果，揭示膝關(guān)節(jié)臭氧水的注射濃度應(yīng) ＜ 30 μg / ml。但肖旭洋等[20]曾報道，20 μg / ml 的臭氧水也能引起家兔膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)變性，明顯低于本研究的臭氧水研究起始濃度 (30 μg / ml)，其原因可能是作者的研究標(biāo)本為膝骨關(guān)節(jié)炎模型，膝骨關(guān)節(jié)炎模型在實驗前已存在軟骨的損傷，與本研究標(biāo)本不一致。Kuroda等[9]進(jìn)行臭氧水抗腫瘤的實驗中發(fā)現(xiàn)，臭氧水不會引起正常組織的不良反應(yīng)，結(jié)論與本研究矛盾。

樊榮等[21]發(fā)現(xiàn)，低濃度臭氧 (20 μg / ml、40 μg / ml) 作用于正常軟骨細(xì)胞后出現(xiàn)少量的核固縮，高濃度臭氧 (60 μg / ml) 注射后出現(xiàn)軟骨細(xì)胞腫脹、空泡樣變及核固縮明顯等。暗示臭氧超過一定濃度會造成軟骨損傷，且隨著濃度增加可能加重?fù)p害程度。本研究臭氧化生理鹽水與膝關(guān)節(jié)軟骨病理損傷的 Spearman 相關(guān)關(guān)系提示，膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度與臭氧化生理鹽水的濃度密切相關(guān)，且隨著臭氧化生理鹽水的濃度增加，膝關(guān)節(jié)軟骨病理損傷程度相應(yīng)加重 (P＜ 0.05)，與作者報道的臭氧作用結(jié)果類似。Kü?ük 等[6]在不同濃度臭氧水對牙髓細(xì)胞毒性的研究中得出，對比較高濃度 (8 mg / L，16 mg / L)臭氧水，較低濃度 (2 mg / L，4 mg / L) 的臭氧水更易促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖。說明臭氧水的作用屬性 (濃度越高，作用越強(qiáng)，產(chǎn)生的不良反應(yīng)也越嚴(yán)重) 與臭氧基本相似[2,5]。

綜上所述，臭氧化生理鹽水濃度 ≥ 30 μg / ml可能對正常家兔膝關(guān)節(jié)軟骨造成損傷，且隨著臭氧化生理鹽水濃度的遞增，引起膝關(guān)節(jié)損傷的程度也會增加。鑒于經(jīng)費和本研究樣本量的限制，結(jié)論有待大樣本、更多實驗進(jìn)一步證實。