董伍真,倪浩亮,蔡 成

董伍真,倪浩亮,蔡成,金華市中心醫(yī)院 浙江省金華市 321000

0 引言

直腸癌發(fā)病率、病死率分別位居惡性腫瘤的第3位、第4位,其主要治療方式為根治性手術(shù),但術(shù)后肝轉(zhuǎn)移已成為致死的重要原因[1,2].異時性肝轉(zhuǎn)移是指切除腫瘤原發(fā)病灶6 mo后出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移,直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率約為20%-25%[3,4].因而早期預(yù)測異時性肝轉(zhuǎn)移趨勢,有助于采取有效干預(yù)、綜合治療.Nomogram模型是由預(yù)測模型變量、變量相應(yīng)得分、預(yù)測事件發(fā)生概率組成,并可將數(shù)據(jù)變?yōu)榭梢暬瘓D形,適用于闡述預(yù)測模型中不同變量間的關(guān)系[5,6].目前直腸癌術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移預(yù)測模型尚未統(tǒng)一,本研究主要探討直腸癌中青年患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的危險因素,基于危險因素構(gòu)建Nomogram模型,并評價該模型對異時性肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能,為臨床綜合治療提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2019-03/2022-02期間本院收治的120例中青年直腸癌患者作為研究對象,納入標(biāo)準(zhǔn): 符合直腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],且經(jīng)病理、影像學(xué)檢查確診;20歲≤年齡＜60歲;術(shù)前影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移;首次診治;術(shù)前未行新輔助治療;術(shù)前肝功能Child-Pugh分級為A級;卡氏評分(KPS)≥60分.排除標(biāo)準(zhǔn): 原發(fā)性肝癌;其他腫瘤所致肝轉(zhuǎn)移;合并其他惡性腫瘤;原發(fā)性癌灶未切除者;心、腎等器官功能障礙者;伴有腦、血液系統(tǒng)疾病者.本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),患者及其家屬知情且簽署知情同意書.

1.2 方法

1.2.1 治療方法: 研究對象均行直腸癌根治術(shù),癌組織下切緣2 cm-3 cm,環(huán)切緣＞1 cm,術(shù)后按照直腸癌診療規(guī)范進行治療[8].術(shù)后以門診、電話方式進行隨訪,每3 mo隨訪1次,共隨訪1年,統(tǒng)計術(shù)后1年異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生情況,異時性肝轉(zhuǎn)移診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]: 肝臟超聲、腹部CT、MRI檢查確診;針對超聲、腹部CT高度懷疑但未能確診患者,需經(jīng)超聲造影等影像學(xué)檢查,還需檢查血清甲胎蛋白水平.

1.2.2 收集臨床資料: 通過調(diào)查研究對象電子病歷收集臨床資料,包括性別、年齡、婚姻狀況、居住地、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤單發(fā)、臨床分期、原發(fā)癌切緣寬度、浸潤深度.

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測外周血端端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)mRNA表達水平: 抽取術(shù)前1 d清晨空腹肘靜脈血5 mL,肝素抗凝后采用淋巴細(xì)胞分層液(美國Amersham Biosciences公司)分離外周血單個核細(xì)胞,加入1 mL Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA.參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化公司)將RNA合成cDNA,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,采用qRT-PCR試劑盒在StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上檢測,以cDNA為模板擴增hTERT mRNA、GAPDH,反應(yīng)體系: 10×PCR Buffer 2.5 μL,MgSO42.5 μL,dNTPs 2.5 μL,正反向引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL.hTERT正向引物5’-ACGGCGACATGGAGAACAA-3’,反向引物5’-CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC-3’;GAPDH正向引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,反向引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’,引物由美國ABI公司設(shè)計合成.采用SDS1.4軟件分析閾值及目的基因相對表達量(2-ΔΔCt法).依據(jù)hTERT mRNA表達平均值分為高表達、低表達.

1.2.4 檢測血清腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)水平: 抽取術(shù)前1 d清晨空腹肘靜脈血5 mL,常規(guī)離心10 min后分離血清,采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(squamous cell carcinoma associated antigen,SCC-Ag)水平,上海科培瑞生物公司提供CEA檢測試劑盒,上海一研生物公司提供SCC-Ag檢測試劑盒.采用ELISA法檢測血清血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、狐猴酪氨酸激酶-3(lemur tyrosine kinase-3,LMTK3)、神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子-1(neuroaxon guidance factor-1,Netrin-1)水平,美國R&D公司提供VEGF檢測試劑盒,上海康朗生物公司提供LMTK3檢測試劑盒,武漢益普生物公司提供Netrin-1檢測試劑盒.

1.3 觀察指標(biāo) (1)統(tǒng)計術(shù)后1年異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生情況;(2)單因素、Logistic回歸分析術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移影響因素并構(gòu)建Nomogram模型;(3)評價預(yù)測模型對術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能.

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 24.0軟件、R4.0.2、Stata/SE15.0分析數(shù)據(jù),χ2檢驗分析計數(shù)資料[n(%)],總例數(shù)＜40或理論頻數(shù)T＜1,采用確切概率法;Ridit檢驗(u)分析等級資料;t檢驗分析計量資料(mean±SD);Logistic回歸分析術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移危險因素;采用rms程序包建立Nomogram模型,采用Bootstrap自抽樣法進行內(nèi)部驗證,計算一致性指數(shù)(C-index),C-index越高表明其預(yù)測價值越高;繪制校正曲線獲取預(yù)測模型預(yù)測的術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生情況與實際結(jié)果之間的一致性;繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線,計算曲線下面積(area under the curve,AUC),檢驗預(yù)測模型對術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值,AUC＞0.9定義為預(yù)測效能較高,0.7≤AUC≤0.9定義為有一定預(yù)測效能,0.5≤AUC＜0.7定義為預(yù)測效能較低,AUC＜0.5定義為無預(yù)測效能;繪制決策曲線分析不同閾值概率下凈收益以此確定臨床效用性,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 中青年直腸癌患者人口學(xué)特征及術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移情況 120例中青年直腸癌患者,男71例,女49例,分別占59.17%、40.83%;年齡22-53歲,平均(41.69±5.12)歲;低分化30例,中分化51例,高分化39例,分別占25.00%、42.50%、32.50%;其中術(shù)后1年發(fā)生異時性肝轉(zhuǎn)移患者有28例,發(fā)生率為23.33%(28/120).

2.2 中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的單因素分析 兩組中青年直腸癌患者分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)癌切緣寬度、浸潤深度、hTERT mRNA表達、CEA水平、VEGF水平、LMTK3水平、SCC-Ag水平、Netrin-1水平相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);兩組中青年直腸癌患者性別、年齡、婚姻狀況、居住地、腫瘤單發(fā)、臨床分期、術(shù)式相比,無顯著差異,見表1.

表1 術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的單因素分析

2.3 中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的多因素分析 經(jīng)上述分析P＜0.05的因素有: 分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)癌切緣寬度、浸潤深度、hTERT mRNA表達、CEA水平、VEGF水平、LMTK3水平、SCC-Ag水平、Netrin-1水平,采用多因素Logistic回歸分析,探究影響中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的有關(guān)因素.

將中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移(未轉(zhuǎn)移=0,轉(zhuǎn)移=1)作為研究對象,利用多因素Logistic回歸方程進行分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果如下: 低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)癌切緣寬度＜2 cm、hTERT mRNA高表達、CEA水平、VEGF水平、LMTK3水平、SCC-Ag水平、Netrin-1水平及浸潤深度T3、T4是中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的危險因素,見表2.

表2 Logistic回歸方程分析參數(shù)

2.4 預(yù)測中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險的Nomogram模型的建立和驗證 基于10項獨立危險因素構(gòu)建中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險的Nomogram模型,見圖1,對應(yīng)中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的概率為0.1-0.9.結(jié)果顯示: 模型一致性指數(shù)(C-index)為0.860(95%CI: 0.827-0.896),見圖2;AUC為0.957(95%CI: 0.907-1.000),見圖3;決策曲線顯示閾值概率在24%-100%范圍內(nèi)時,凈獲益值較高,見圖4.

圖1 預(yù)測中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險的Nomogram模型.CEA: 血清癌胚抗原;VEGF: 血管內(nèi)皮生長因子;LMTK3: 狐猴酪氨酸激酶-3;SCC-Ag: 鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原;Netrin-1: 神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子-1.

圖2 Nomogram模型的校正曲線.B=1000重復(fù)次數(shù),Boot絕對平均誤差=0.037,n=120;橫軸代表Nomogram模型預(yù)測中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生概率,豎軸代表中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移實際發(fā)生概率,對角虛線為理想曲線,實線為本研究Nomogram模型的預(yù)測效能,越與對角虛線接近,提示Nomogram模型預(yù)測效能越優(yōu)異.

圖3 Nomogram模型的ROC曲線.

圖4 Nomogram模型的決策曲線.

3 討論

直腸癌肝轉(zhuǎn)移與機體免疫、肝臟微環(huán)境、腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性有關(guān)[10].同時性肝轉(zhuǎn)移在手術(shù)治療前可通過影像學(xué)、病理學(xué)檢查確診,但術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞數(shù)減少,常規(guī)檢查無法進行早期診斷[11,12].

多因素Logistic回歸分析可研究分類觀察結(jié)果、協(xié)變量間的關(guān)系,可用于分析誘發(fā)疾病的高危因素,本研究中低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)癌切緣寬度＜2 cm、hTERT mRNA高表達、血清CEA、VEGF、LMTK3、SCC-Ag、Netrin-1水平升高及浸潤深度T3、T4是中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的危險因素.腫瘤低分化可增加侵犯靜脈發(fā)生風(fēng)險,可能是異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生的危險因素[13].本研究結(jié)果顯示低分化者轉(zhuǎn)移率明顯高于未轉(zhuǎn)移者,提示分化程度降低與術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移有關(guān)[14].原發(fā)癌切緣寬度可影響肝轉(zhuǎn)移,但關(guān)于切緣寬度存在一定爭議[15].本研究顯示原發(fā)癌切緣寬度＜2 cm者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險是原發(fā)癌切緣寬度≥2 cm者的4.770倍,提示在避免腫瘤細(xì)胞擴散的前提下,直腸癌根治術(shù)中應(yīng)盡量增加原發(fā)癌切緣寬度.浸潤深度越深,腫瘤細(xì)胞易沿著淋巴結(jié)、血管發(fā)生轉(zhuǎn)移[16].本研究發(fā)現(xiàn)浸潤深度T3、T4者肝轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險升高.因而臨床應(yīng)在術(shù)前評估直腸癌患者浸潤深度,以降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險.

hTERT與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),可用于評估直腸癌患者預(yù)后[17].本研究結(jié)果顯示hTERT mRNA高表達、低表達者發(fā)生術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險比為7.091.臨床醫(yī)師應(yīng)監(jiān)測外周血hTERT表達水平,有助于早期發(fā)現(xiàn)術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移者.CEA屬于膜糖蛋白,術(shù)前CEA水平升高者肝臟或其他器官可能已存在轉(zhuǎn)移[18].本研究通過單因素、多因素Logistic回歸分析顯示CEA水平升高可增加術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險,這與既往研究結(jié)果相似[19].分析其原因可能為CEA水平升高可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶1/2表達,刺激肝轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,促進腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移[20].提示臨床應(yīng)關(guān)注術(shù)前血清CEA水平較高者,術(shù)后增加隨訪次數(shù).血管生長可能是術(shù)后肝轉(zhuǎn)移的影響因素,VEGF可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,促進腫瘤血管增生,促進腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移[21,22].本研究結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)移組血清VEGF水平高于未轉(zhuǎn)移組,且VEGF水平升高可增加術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生風(fēng)險.LMTK3可介導(dǎo)PKC信號通路參與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程[23,24].SCC-Ag是一種由鱗狀細(xì)胞產(chǎn)生的特異性抗原,其水平升高與癌細(xì)胞生長、增殖密切相關(guān)[25].本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移組血清LMTK3、SCC-Ag水平高于未轉(zhuǎn)移組,這與既往研究結(jié)果相似[26].Netrin-1可激活整合蛋白受體調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號通路,促進腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成[27].本研究結(jié)果顯示Netrin-1水平升高是術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的危險因素,其原因可能為Netrin-1可能激活PI3K/AKT信號通路,促進癌細(xì)胞增殖、分化,引起免疫炎性反應(yīng)紊亂,促使肝轉(zhuǎn)移發(fā)生.本研究基于術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的危險因素構(gòu)建Nomogram模型,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)驗證,該模型校準(zhǔn)度、C-index、AUC、預(yù)測精準(zhǔn)度良好,提示該模型具有較高預(yù)測效能與一致性.

4 結(jié)論

綜上所述,低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、原發(fā)癌切緣寬度＜2 cm、hTERT mRNA高表達、血清CEA、VEGF、LMTK3、SCC-Ag、Netrin-1水平升高及浸潤深度T3、T4是中青年直腸癌患者術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的危險因素,基于上述危險因素構(gòu)建Nomogram模型,可有效預(yù)測術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移發(fā)生概率,可為臨床防控工作提供參考.

文章亮點

實驗背景

我國直腸癌發(fā)生率逐年上升,臨床常采用手術(shù)治療,可提高患者生存率,但患者預(yù)后較差,主要與術(shù)后肝轉(zhuǎn)移有關(guān),病理診斷可用于診斷肝轉(zhuǎn)移,但具有一定滯后性,因而需尋找新型預(yù)測指標(biāo)或預(yù)測方案,有助于早期診斷術(shù)后肝轉(zhuǎn)移,改善患者預(yù)后.

實驗動機

Nomogram模型具有可視化、可解釋性等特點,可闡述不同變量間關(guān)系,有助于指導(dǎo)臨床醫(yī)師采取針對性措施,目前直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移相關(guān)Nomogram模型尚未明確,因而建立Nomogram模型成為研究重點.

實驗?zāi)繕?biāo)

分析并篩選直腸癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移相關(guān)影響因素,并構(gòu)建Nomogram模型,模型中不同變量對應(yīng)相應(yīng)得分,可依據(jù)分值預(yù)測事件發(fā)生概率,然后評價并驗證該模型對異時性肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值及其臨床實用性,可為臨床治療提供科學(xué)依據(jù).

實驗方法

(1)單因素、多因素Logistic回歸分析直腸癌術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移影響因素;(2)依據(jù)篩選后的影響因素構(gòu)建Nomogram模型;(3)利用ROC曲線、決策曲線、校正曲線分別驗證該模型區(qū)分度、校準(zhǔn)度及臨床效用性.

實驗結(jié)果

低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T3/T4、原發(fā)癌切緣寬度＜2 cm、外周血hTERT高表達及血清CEA、VEGF、LMTK3、SCC-Ag、Netrin-1水平升高為術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的危險因素,依據(jù)上述危險因素構(gòu)建Nomogram模型,該模型預(yù)測術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移的AUC為0.957,且區(qū)分度、校準(zhǔn)度良好.

實驗結(jié)論

基于低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T3/T4、原發(fā)癌切緣寬度＜2 cm、外周血hTERT高表達及血清CEA、VEGF、LMTK3、SCC-Ag、Netrin-1水平構(gòu)建Nomogram模型,其對術(shù)后異時性肝轉(zhuǎn)移具有一定預(yù)測價值.

展望前景

本研究建立Nomogram模型還需結(jié)合內(nèi)外部綜合驗證,并擴大樣本量試圖納入更多因素,以提高模型預(yù)測效能.